簡介：河北醫(yī)科大學學位論文使用授權及知識產(chǎn)權歸屬承諾本學位論文在導師或指導小組的指導下，由本人獨立完成。本學位論文研究所獲得的研究成果，其知識產(chǎn)權歸河北醫(yī)科大學所有。河北醫(yī)科大學有權對本學位論文進行交流、公開和使用。凡發(fā)表與學位論文主要內容相關的論文，第一署名單位為河北醫(yī)科大學，試驗材料、原始數(shù)據(jù)、申報的專利等知識產(chǎn)權均歸河北醫(yī)科大學所有。否則，承擔相應的法律責任。一虢香緋靳虢形那日河北醫(yī)科大學研究生學位論文獨創(chuàng)性聲明本論文是在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特別加以標注等內容外，文中不包含其他人已發(fā)表或撰寫的研究成果，指導教師對此進行了審定。本論文由本人獨立撰寫，文責自負。研究生簽名砑匈囂導師簽章紗F年6月7日目錄中文摘要1英文摘要3研究論文兒童感染流感嗜血桿菌分子生物學鑒定及分型研究前言5剛舌5材料與方法6結果14附圖16附表21討念24結論28參考文獻29綜述流感嗜血桿菌分型的研究進展34致謝44個人簡歷45

簡介：溫州醫(yī)學院碩士學位論文前列腺癌外周血微轉移的免疫磁珠分選和分子生物學檢測姓名沈默申請學位級別碩士專業(yè)臨床檢驗診斷學指導教師陶志華陳曉東20080501溫州醫(yī)學院碩士學位論文周血微轉移發(fā)生的臨床應用價值進行了分析評價。結果1、成功建立免疫磁珠法檢測外周血微轉移前列腺癌細胞的方法學。隨著PSMA單克隆抗體濃度的增高，LNCAP細胞與免疫磁珠的結合率也增高。當單抗?jié)舛葹?,UG／ML時，結合率最高，玫瑰花環(huán)形成率可達到90％，單抗?jié)舛壤^續(xù)增加，二者結合率不再升高并略有下降。且分選后癌細胞存活率較之分選前未明顯改變。該方法敏感性高，當PBMC與LNCAP細胞比例為1061時可以檢測到癌細胞，檢測靈敏度可達20個腫瘤細胞／ML外周血。2、臨床病例檢測結果5例正常對照者中未檢測到陽性結果；30例BPH患者中檢測到1例陽性；53例前列腺癌患者中有23例陽性，陽性率43．4％，其中ECT證實的27例骨轉移癌患者中，有17例陽性，陽性率達到63％。結論免疫磁珠法是一種高效、快捷、靈敏、特異并且臨床實用價值高的檢測技術，可為臨床早期發(fā)現(xiàn)前列腺癌微小殘留提供新的思路，其聯(lián)合實時熒光定量RTPCR方法判斷前列腺癌患者外周血微轉移的發(fā)生有助于轉移前列腺癌的早期診斷及其治療和預后判斷。關鍵詞免疫磁珠分選；前列腺癌；微轉移；前列腺特異抗原；逆轉錄一聚合酶鏈反應2

簡介：點擊查看更多蚊蟲抗菌肽defensin的分子生物學研究及其與登革Ⅱ型病毒感染關系的探討.pdf精彩內容。

簡介：南京醫(yī)科大學碩士學位論文滑膜肉瘤的組織病理學，免疫組織化學及分子生物學研究姓名楊翎申請學位級別碩士專業(yè)病理學指導教師范欽和馮振卿200404202免疫組織化學SP法標記抗體，36例滑膜肉瘤病例中，腫瘤細胞土皮樣細胞包括艨渲樣結構區(qū)域C＆陽妊27例750％，EMA陽性30侈4833％，梭形細胞區(qū)域VIM陽性35例972％，DES陽蛀4鍘IL。L籬，ST00茸蛙1鍘28鬣，PGP鞠穗26倒722強，PCNAFEL陛33例917％；DES和S一100均為局灶或散在弱陽性。其中E受或EMA≯霹性合同時F隧蛀，VIM闋時F酲性31倒861％；CK和EMA均陰性，VILLL陽性4例111％；CK和EMA均陰性，VIM陰性1側28％。SMA均為陰性。3每次實驗均檢測到看家基因PBGDRNRNA的表迭。20例被檢測滑膜肉瘸中，18例90％檢測到融合基因SYTSSX的表達。其中SYTSSXL型占L2侈667％，SYTSSX2型占6移4333強。12欏4SYT～SSXL融合基因檢測陽性的滑膜肉瘸標本中，9例75％為單相型滑膜肉瘤，余3例為雙翻窒。6鍘SYTSSX2融合基西檢測稿蛀敲滑貘肉瘤標本中，4例667％為單相型滑膜肉瘤余2例為雙相型?？p論1滑膜肉瘤的確診有賴于四方面的資料1臨床資料青壯年，發(fā)生于四肢大關節(jié)附近軟組織中的腫塊。2光學顯微鏡觀察，有雙相分化的線索如腺腔樣結構；腮大細胞的出現(xiàn)更支持診斷的作出。3免疫組織化學標記，出現(xiàn)上皮性抗體CK或EMA和溺葉性抗體VIM的同時表達，進一步支持診斷。4分子生物學實驗RTPCR，檢測到轉異性易位TX；LG

簡介：論文題目越屋疸太鼠塑圈腿史亞￡二塑Y豎￡的筮王生物堂塞達拯壘迦蘭地Q過墓的王亟答辯委員會主席沈曄教授浙江大學附屬第一醫(yī)院答辯委員會成員沈曄主席施明光教授溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院鄭海華教授溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院論文答辯日期2013年5月26日溫州醫(yī)學院碩上學位論文英文縮略詞表英文縮寫AGNCONCXCR4DMDREPCHSCPBSRTPCRSDFLSDSPAGESPFSTZVEGFWB英文全稱ANTAGONISTSGROUPCONTROLGROUPCXCCHEMOKINERECEPTOR4DIABETETSMELLITUSGROUPDIABETICRETINOPATHYENDOTHELIALPROGENITORCEILHEMATOPOIETICSTEMCELLPHOSPHATEBUFFEREDSALINE中文全稱拮抗劑組對照組趨化因子受體CXCR4糖尿病組糖尿病視網(wǎng)膜病變內皮祖細胞造血干細胞磷酸鹽緩沖液REVERSETRANSERIPTI。NP。1YMERASE逆轉錄聚合酶鏈式反應CHAINREACTIONSTROMALCELLDERIVODFACTOR1基質細胞衍生因子一1SODIUMDODECYLSULFATE十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰POLYACRYLAMIDEGELELECTROPHERESIS胺凝膠電泳SPECIFICPATHOGENFREE無特定病原體STREDTOZOTOCIN鏈脲佐菌素VASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTOR血管內皮生長因子WESTERNBLOT蛋白免疫印跡

簡介：博士學位論文學校代碼10023學號B2008162膀胱癌分子分型和分子網(wǎng)絡的系統(tǒng)生物學研究ANINTEGRATIVESTUDYONMOLECULARCLASSIFICATIONANDMOLECULARNETWORKSOFBLADDERUROTHELIAICARCINOMA所院姓名指導教師導師小組學科專業(yè)研究方向完成日期北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所鄭陽高燕寧程書鈞張開泰壽建忠腫瘤學基礎癌發(fā)生演進的分子機理和分子標志2011年5月目錄圖表索引VI英文縮略詞VLLL摘要”IXABSTRACT”XL第一章導論1一、膀胱癌的概述L二、基因芯片技術及其應用”31基因芯片的種類一311用于分析基因組結構改變312用于分析基因組功能改變32基因芯片技術在腫瘤研究與臨床實踐中的應用43利用基因芯片數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)生物學的研究531系統(tǒng)生物學的概述532基因芯片在系統(tǒng)生物學研究中的應用”6三、膀胱癌相關基因組結構與功能改變的研究一61膀胱癌相關基因組結構的異常改變62膀胱癌相關基因組功能的異常改變73膀胱癌的系統(tǒng)生物學研究8四、問題與展望9五、本課題的研究目的和研究策略10第二章以DNA拷貝數(shù)改變鑒別非浸潤性與浸潤性膀胱癌的研究12一、結果121膀胱癌組織的ARRAYCGH分析一1211獲得高質量基因組DNA”1212酶切GDNA1213GDNA的標記、純化以及與基因芯片雜交1314雜交后芯片數(shù)據(jù)的提取132膀胱癌組織ARMYCGH實驗數(shù)據(jù)分析142145例膀胱癌組織中GDNA異常改變情況142265例膀胱癌樣品基因組DNA變化情況15221芯片數(shù)據(jù)均一化L5222基因組DNA拷貝數(shù)改變情況L7223對ARMYCGH芯片分析結果的組織樣品驗證20I

簡介：T細胞的有效活化需要雙信號其中共刺激分子在免疫調節(jié)中發(fā)揮著重要的作用B7H3是共刺激分子B7家族成員之一。人B7H3有兩種不同形式的剪切體2IGB7H3和4IGB7H3。2IGB7H3胞外段由IGVIGC兩個免疫球蛋白結構域組成而4IGB7H3胞外段由IGV1IGC1IGV2IGC2四個免疫球蛋白結構域組成。研究報道發(fā)現(xiàn)4IGB7H3是人各組織細胞中B7H3的主要表達形式目前仍缺乏對兩種剪切體的差異研究。許多共刺激分子分別以細胞膜型和可溶型兩種形式存在。本實驗室在健康人外周血和組織液中發(fā)現(xiàn)存在天然形式的SB7H3且發(fā)現(xiàn)SB7H3僅源于2IGB7H3。基因序列研究發(fā)現(xiàn)4IGB7H3胞外段4個結構域是由編碼2IGB7H3IGV和IGC外顯子復制的結果2IGB7H3和4IGB7H3兩種剪切體的同源性超過95％本研究通過氨基酸序列比對和分析發(fā)現(xiàn)在人4IGB7H3分子第一個C樣免疫球蛋白結構域碳端末端存在一段獨特的氨基酸序列為“PQRSPT”其在2IGB7H3分子序列中缺失。本研究以此為出發(fā)點獲得了增加“PQRSPT”基序的2IGB7H3ADD基因和缺失“PQRSPT”基序的4IGB7H3DEL基因并構建相應的基因轉染細胞株以此來探討“PQRSPT”基序在人B7H3基因生物學功能及可溶性B7H3產(chǎn)生過程中的分子機制。㈠2IGB7H3ADD與4IGB7H3DEL基因轉染細胞株的建立。RTPCR法分別擴增2IGB7H3與4IGB7H3編碼區(qū)全長基因并通過拼接PCR的方法獲得增加“PQRSPT”基序的2IGB7H3ADD基因和缺失“PQRSPT”基序的4IGB7H3DEL基因。將兩個目的基因片段雙酶切后與PIRES20EGFP真核表達載體連接構建重組子PIRES2EGFP2IGB7H3ADD和PIRES2EGFP4IGB7H3DEL經(jīng)測序鑒定正確后通過脂質體轉染法將兩個重組載體分別導入小鼠L929細胞。RTPCR結果表明表明導入的外源性2IGB7H3ADD和4IGB7H3DEL基因已分別成功整合到L929細胞基因組中并能成功地進行轉錄；通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)GFP和B7H3蛋白在兩株細胞表面均穩(wěn)定高表達；WESTERNBLOT分析結果顯示L9292IGB7H3ADD和L9294IGB7H3DEL細胞均能成功表達B7H3蛋白。㈡“PQRSPT”基序在人B7H3基因生物學功能中的分子機制研究。收集上述基因轉染細胞的培養(yǎng)上清進行ELISA和WESTERNBLOT分析結果顯示在2IGB7H3和4IGB7H3DEL基因轉染細胞培養(yǎng)上清中存在可溶性B7H3蛋白而4IGB7H3和2IGB7H3ADD基因轉染細胞培養(yǎng)上清與對照組一樣都未檢測出可溶性形式的存在。該研究結果表明保守性氨基酸“PQRSPT”可能是人4IGB7H3不能形成可溶性形式的一個重要基序。同時基因轉染細胞與外周血T細胞共培養(yǎng)的淋巴細胞增殖實驗及分泌細胞因子的檢測實驗結果發(fā)現(xiàn)2IGB7H3基因轉染細胞能顯著地促進T細胞體外增殖與細胞因子IL2和IFNΓ的分泌相比之下增加“PQRSPT”基序的2IGB7H3ADD基因轉染細胞則無此效應4IGB7H3基因轉染細胞能顯著抑制T細胞的增殖與細胞因子IL2和IFNΓ的分泌而缺失“PQRSPT”基序的4IGB7H3DEL基因轉染細胞則無明顯作用。以上研究結果均證實“PQRSPT”基序可能是4IGB7H3分子中的功能結構域且對B7H3生物學功能的改變具有重要作用。㈢本實驗成功構建了L9292IGB7H3ADD和L9294IGB7H3DEL兩株轉基因細胞對基因轉染細胞株培養(yǎng)上清中SB7H3的檢測結果表明了“PQRSPT”基序與人4IGB7H3分子不能分泌可溶性形式密切相關。T細胞體外增殖實驗顯示兩株基因轉染細胞均對T細胞的增殖和細胞因子的分泌無效應表明“PQRSPT”基序可能是4IGB7H3分子發(fā)揮抑制作用的重要基序。上述結果為進一步闡明SB7H3的來源機制提供新的思路以及為研究人B7H3兩種剪切體的差別性奠定了分子基礎。

簡介：【目的】本實驗目的是探討一種簡便的適合漢族人的RHD基因分型方法并應用該方法初步分析RHD陰性伴抗D個體的分子生物學特征為指導RHD陰性患者合理用血及RHD陰性產(chǎn)婦產(chǎn)后是否要進行RHD免疫球蛋白干預治療提供初步的理論依據(jù)。【方法】1利用PCRSSP技術對116例標本RHD特異性外顯子7和內含子4進行篩查。2對內含子4和外顯子7篩查為陰性標本運用PCRSSP技術檢測RHD基因啟動子和外顯子10。3對外顯子7和內含子4陽性及啟動子和外顯子10篩查陽性的標本進行RHD特異性的外顯子3、4、5、6、7、9檢測。4內含子4和外顯子7為陽性的標本使用BAGENERHDTYPEASIA試劑盒檢測RHDK409K。5通過PCRSSP的方法對檢測出的RHDK409K標本進行驗證?！窘Y果】1116例標本中有83例為RHD基因缺失占715％有8例為RHD基因外顯子2～9缺失占69有24例為DELK409K占2072抗D組23例標本均為RHD基因缺失。3在27例無抗D組中10例為DEL2例RHD外顯子2～9缺失15例RHD基因缺失。【結論】1本基因分型方法簡便可快速對RHD陰性標本中RHD基因進行初步分型。2RHD基因缺失為RHD陰性血型的主要分子生物學特征。3DEL為RHD陰性血型的次主要分子生物學特征。4攜帶DEL的個體是否可以接收RHD陽性輸血及DEL孕婦產(chǎn)后是否需要接受抗D免疫球蛋白預防注射還需進一步研究。

簡介：復旦大學臨床醫(yī)學碩士研究生畢業(yè)論文ARDS行控制性肺膨脹的分子生物學機制研究STUDYONMOLECULARMECHANISMOFSUSTAINEDINFLATIONINACUTERESPIRATYDISTRESSSYNDROME院系華山醫(yī)院專業(yè)急診醫(yī)學姓名方勇導師曹同瓦教授導師小組祝禾辰教授趙鋒主治醫(yī)師復旦大學碩士學位論文ARDS行控制性肺膨脹的分子生物學機制研究縮略詞中英文對照表英文縮寫英文全稱中文全稱ALIACUTELUNGINJURY急性肺損傷AQP1AQUAPIN1水通道蛋白IAQP5AQUAPIN5水通道蛋白5ARDSACUTERESPIRATYDISTRESSSYNDROME急性呼吸窘迫綜合征COCARDIACOUTPUT心排出量CPAPCONTINUOUSPOSITIVEAIRWAYPRESSURE持續(xù)氣道正壓CSTSTATICLUNGCOMPLIANCE靜態(tài)肺順應性ELISAENZYMELINKEDIMMUNOSBENTASSAY酶聯(lián)免疫吸附試驗FI02FRACTIONOFINSPIREDOXYGEN吸入氧濃度FLIPFLICELIKEINHIBITYPROTEINFLICE樣抑制蛋白HMGB1HIGHMOBILITYGROUPBOX1高遷移率族蛋白】ILLPINTERLEUKIN1P白介素13IL6LNTERLEUKIN6白介素6IL10INTERLEUKIN10白介素10MAPMEANARTERIALPRESSURE平均動脈壓PAWPPULMONARYARTERYWEDGEPRESSURE肺動脈楔壓RTPCRREALTIMEPOLYMERASECHAINREACTION實時聚合酶鏈式反應PA02PARTIALPRESSUREOFOXYGENINARTERY動脈氧分壓PEEPPOSITIVEENDEXPIRATYPRESSURE呼氣末正壓PIPPEAKINSPIRATYPRESSURE氣道峰壓PMNPOLYMPHONUCLEARNEUTROPHILS多形核中性粒細胞RAIRWAYRESISTANCE氣道阻力RMRECRUITMENTMANEUVER肺復張SISUSTAINEDINFLATION控制性肺膨脹SPASURFACTANTPROTEINA表面活性蛋白ATNFATUMNECROSISFACTALPHA腫瘤壞死因子A

簡介：全文分上、下兩篇上篇睪丸功能相關HRABJMRABJ全長新基因的分子克隆與生物學功能研究我們發(fā)現(xiàn)了人和小鼠的一個優(yōu)勢表達于睪丸組織的新型RAB分子其獨特地同時擁有兩個家族分子RAB和DNAJHSP40的特點結合免疫組織化學和亞細胞定位研究我們推測RABJ的主要生物學功能是在睪丸組織中通過介導HSC70向核內的轉運共同調控機體對熱應激的防護從而參與睪丸的生精過程由于我們克隆了小鼠的RABJ分子因此將非常有利于RABJ在生殖和發(fā)育中的功能和機制的探討下篇一種新型參與細胞內吞的RAB分子全長新基因的克隆和生物學功能研究我們發(fā)現(xiàn)了一個參與內吞的新型RAB分子其廣泛表達于多種組織和細胞系而且在瞬時高表達后可以增強細胞的內吞效應因此我們認為RAB39是一個在多種組織和細胞中發(fā)揮介導內吞功能的新型RAB蛋白但是RAB39的作用機制尚不清楚亞細胞共聚焦顯微鏡定位及分布裂解可能有助于該問題的解決在RAB39的蛋白序列中有兩個磷酸化位點提示RAB39可能參與信號轉導或受其它信號轉導分子如MAPK家族分子的調控另外由于RAB39廣泛表達于多種免疫細胞系中其潛在的免疫學功能也有待于進一步的研究

簡介：上海交通大學醫(yī)學院2008級博士學位論文上海交通大學博士學位論文ALCL基因在結直腸癌中的生物學作用及其分子機制研究研究生姓名季曉頻研究生學號0087209114培養(yǎng)單位瑞金醫(yī)院學科專業(yè)外科學導VILI朱正綱教授導師組成員劉炳亞教授于穎彥教授趙任主任醫(yī)師燕敏主任醫(yī)師論文答辯日期二O一一年五月本課題由上海市科委重點課題10JCL411100上海市胃腫瘤重點實驗室科委重點課題09DZ2260200上海市重點學科夕’科學課題30204上海市重大科技專項09DZL950100資助上海交通大學醫(yī)學院2008級博士學位論文上海交通大學上JJI母交通大字學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解學校有關保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權上海交通大學可以將本學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。本學位論文屬于保密口，在一年解密后適用本授權書。不保密彳請在以上方框內打“4”學位論文作者簽名日翅、11年R月7曰／沙IIJ喉似繕怕各R簽年教紉導【甑匕日一韶一

簡介：目的男男性接觸者MENWHOHAVESEXWITHMEN，MSM指與其他男性進行性行為的男性，包括同性戀，雙性戀，異性戀和易性者。1981年，艾滋病首先在美國一組男同性戀者中被確認。MSM成為世界上第一個被確認的艾滋病高危人群。全球HIV監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，近年來MSM人群的HIV1感染率有上升趨勢。我國最新的艾滋病疫情報告也顯示，新發(fā)男男性接觸感染者連續(xù)幾年呈明顯上升趨勢，2011年48萬HIV1新發(fā)感染中，同性傳播占294％，MSM已成為新發(fā)感染數(shù)最大的高危人群。因此，目前最迫切的工作是加深對MSM人群HIV1感染情況的了解，明確MSM人群中主要流行毒株及其流行規(guī)律，為有針對性的制定預防控制措施提供理論基礎。多位學者的研究表明，56％92％的新感染是由處在急性期的感染者傳播的還有研究顯示，這些引起感染的毒株可能是被選擇出來傳播給新宿主的。對經(jīng)異性傳播HIV1感染者的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)生殖道粘膜屏障傳播的毒株存在明顯的傳播瓶頸效應，大多數(shù)建立有效的感染HIV1傳播是由單一的TRANSMITTEDFOUNDERVIRUSES（TF毒株）引起的。因此，如果在病毒尚未廣泛擴散及整合形成病毒潛伏庫時進行有針對性的治療，建立感染的病毒和病毒感染的細胞是有可能被清除的。然而由于難以獲得感染早期病毒復制的粘膜部位標本，目前對于這些引起HIV1傳播和感染的TF毒株的生物學特性和進化的分子機制仍不清楚。而且，男性和女性在泌尿生殖道和直腸的解剖學和免疫組織學上存在較大差異，使得上述對異性傳播感染者實驗得到的結果并不完全適用于解釋MSM中傳播的TF毒株的特征及在HIV1傳播和建立持續(xù)感染中的作用。此外，由于HIV1具有眾多亞型，病毒基因組序列高度多樣化而且通過不同途徑傳播的TF毒株在基因型和表現(xiàn)型方面存在明顯的差異。因此，為了尋找更好地控制HIV1在MSM人群中的傳播蔓延并改善臨床預后的方法，就需要進一步深入開展MSM人群HIV1主要流行的TF毒株的生物學特征及致病機理等基礎研究。由于HIV感染缺乏理想的動物模型，HIV的體外感染性分子模型即感染性分子克隆成為不可或缺的一種重要研究工具，也為開展該病毒的分子致病機理、基因組結構與功能等基礎應用研究提供了前提條件。但目前世界上現(xiàn)有的感染性分子克隆大都是利用歐美和非洲國家的B和C亞型毒株構建而成，并不適用針對中國HIV1主要流行毒株的研究。目前，我國對MSM人群中HIV1感染者的研究主要為HIV1感染率及社會學和行為學的調查，僅有數(shù)篇小樣本MSM人群HIV1感染者的病毒亞型分析的報道，而關于該人群HIV1感染主要流行株的遺傳學和病毒學特性的信息較少。我國至今僅有來源于既往有償獻血員中流行的B啞型以及IDUS感染者中流行的CRF07_BC和CRF08_BC亞型的感染性分子克隆，尚未見目前新發(fā)感染數(shù)最大的高危人群MSM中主要流行毒株感染性分子克隆的相關報道，更無其早期傳播毒株感染性分子克隆的報道。綜上所述，本研究在全國第二大MSM聚集地的遼寧省，對MSM中的HIV1感染者進行分子流行病學調查，明確在我國MSM中主要流行的病毒亞型，并選取其中有代表性的早期傳播毒株分離其原代病毒株，并進行感染性分子克隆的構建，借助此感染性分子克隆對MSM中主要流行毒株進行生物學特性研究，為探討MSM中HIV1快速傳播的機制以及研發(fā)有效的抗病毒藥物和疫苗等方面的研究提供良好的技術平臺。方法一、研究對象229名經(jīng)男男性接觸感染HIV1的成年（18歲以上）男性。征得患者的知情同意后進行面對面問卷調查采集相關流行病學信息，所有病例均否認靜脈吸毒史和賣輸血史，在采集血樣時均未接受任何抗艾滋病毒治療采集EDTA抗凝外周靜脈血，6小時內常規(guī)離心，分離血漿，分裝后80℃低溫保存。二、實驗方法（一）病毒核酸提取以140ΜL血漿按照QIAAMPVIRALRNAMINIKIT說明書步驟提取病毒基因組RNA。以1106個細胞按照QIAAMPDNABLOODMINIKIT說明書步驟提取前病毒基因組DNA。（二）PCR擴增、產(chǎn)物純化及基因序列測定使用反轉錄PCR和套式PCR方法，分別擴增POL基因NT22523299，蛋白酶199密碼子和反轉錄酶1250密碼子和ENV基因NT70117715，C2V5。PCR產(chǎn)物純化參照QIAQUICKGELEXTRACTIONKIT操作步驟。利用測序引物進行測序反應，純化后上機檢測。（三）序列分析采用BIOEDIT軟件對測序結果進行編輯處理，然后進行拼接。用MEGA50軟件自展法BOOTSTRAP重復運算1000次構建NEIGHBJOININGNJ進化樹。利用MEGA軟件中的DISTANCE程序中的KIMURA雙參數(shù)方法計算序列間的基因離散率。用HIVDATABASE中VESPA軟件分析兩個流行簇毒株遺傳變異特征HIGHLIGHTER軟件對序列進行比較，并標記出匹配不匹配、有義無義突變及超突變等特征。用GENO2PHENO軟件預測對病毒的輔助受體使用情況。（四）病毒載量測定以1ML血漿采用標準版模板制備法提取RNA，使用COBASAMPLIPREPCOBASTAQMANHIV120ROCHE以TAQMANRTPCR方法測定病毒載量。（五）HIV1抗體檢測1、ELISA法使用法國生物梅里埃公司第三代檢測試劑盒，參照試劑盒說明書進行檢測。2、WB法使用新加坡MP生物醫(yī)學亞太私人有限公司人類免疫缺陷病毒HIV12型抗體檢測試劑盒，參照試劑盒說明書進行檢測。（六）SGA法擴增近全長序列及基因序列測定使用反轉錄PCR和套式PCR方法，分別擴增5AMPLICONNT6345066和3AMPLICONNT49009612。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至華大基因科技有限公司（北京）進行WALKINGSEQUENCING。（七）擴增全長序列及基因序列測定使用套式PCR方法，分別擴增5HALFGENOMENT15066和3HALFGENOMENT49009719。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至華大基因科技有限公司（北京）進行WALKINGSEQUENCING。（八）分子克隆1、半分子克隆參照TOPOXLPCRCLONINGKIT說明書，純化PCR產(chǎn)物后，進行TOPO克隆反應和化學轉化，構建半分子克隆。2、質粒提取及基因序列測定參照QIAPREPSPINMINIPREPKIT說明書提取半分子克隆的質粒DAN進行酶切、電泳鑒定。經(jīng)鑒定已插入目的片段的半分子克隆送至華大基因科技有限公司（北京）進行WALKINGSEQUENCING。3、全基因組克隆及基因序列測定分別將5和3半分子克隆用NDEⅠ和NOTⅠ雙酶切并純化后，分別回收85KB和5KB片段在T4DNA連接酶作用下，于4℃連接過夜經(jīng)酶切和電泳鑒定已插入目的片段的全基因組克隆送至華大基因科技有限公司（北京）進行WALKINGSEQUENCING。（九）質粒DNA的轉染參照FUGENE6TRANSFECTIONREAGENT說明書將全基因組克隆轉入293T細胞37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48小時，取200ΜL上清進行HIV1P24抗原檢測，2ML凍存于156℃。（十）WB法檢測轉染后的293T細胞中的蛋白表達情況參照分子克隆提取轉染后293T細胞的蛋白，進行SDSPAGE電泳后轉至PVDF膜，分別與一抗和二抗封閉作用后，參照ECL顯色試劑盒說明書進行檢測。（十一）HIV1病毒分離利用密度梯度離心法分離正常人和HIV1感染者的PBMC采用PBMC共培養(yǎng)法復制病毒。每34天換液1次，每7天添加1次經(jīng)PHA刺激生長3天的正常淋巴細胞。定期對培養(yǎng)細胞上清中的HIV1P24抗原含量進行檢測。（十一）HIV1病毒生物學特性研究利用TZMB1細胞檢測病毒感染性，利用PBMC檢測病毒復制能力，利用GHOSTCD4CXCR4CCR5細胞檢測病毒輔助受體利用情況。（十二）HIV1P24抗原檢測參照美國ZEPTOMETRIX公司HIV1P24抗原定量檢測試劑盒說明書進行檢測。（十三）統(tǒng)計學處理本研究涉及統(tǒng)計分析和相關性分析均采用SPSS180軟件包處理。結果一、MSM人群中流行的HIV1主要基因型及其特征研究（一）遼寧省MSM人群HIV1感染者基因亞型分布及與全國流行毒株的關系利用NJ系統(tǒng)進化樹綜合分析POL和ENV基因序列，發(fā)現(xiàn)我省MSM人群HIV1感染者中存在CRF01_AE、BB、CRF07_BC3種亞型。其中CRF01_AE亞型占856％196229，BB亞型占96％22229，CRF07_BC占35％8220。其中CRF01_AE亞型毒株主要分為兩簇，CLUSTER1毒株與我國其他地區(qū)MSM中流行毒株聚集成簇，推測其與我國MSM中廣泛流行毒株具有更近的遺傳親緣關系CLUSTER2毒株雖人數(shù)眾多，但組內基因距離較小，同源性較高，且與我省經(jīng)異性傳播毒株距離較近，提示可能經(jīng)異性接觸傳入，由奠基者效應引起在遼寧省內MSM人群的擴散傳播。（二）遼寧省MSM人群HIV1感染者基因亞型分布的歷年演變情況20002010每年新確診病例中CRF01_AE亞型均占720％以上，為遼寧省MSM人群主要的HIV1流行毒株。其中CLUSTER1上升趨勢顯著，而CLUSTER2自2008年開始下降。相同的趨勢也出現(xiàn)在2009年和2010年新發(fā)現(xiàn)的急性HIV1感染者中。因此，推測雖然CLUSTER2毒株在遼寧省MSM中感染者存在一定的奠基者效應，而CLUSTER1毒株近年來增加較快，值得關注。（三）遼寧省MSM人群HIV1感染者中流行的CRF01AE毒株V3區(qū)氨基酸特征V3區(qū)頂端四肽是最重要的中和抗體決定簇，CLUSTER1毒株主要表現(xiàn)為GPGQ而CLUSTER2毒株主要為GPGR，兩者存在顯著性差異。經(jīng)比較CLUSTER1和CLUSTER2毒株在輔助受體利用情況上無差異，均以CCR5作為輔助受體為主。CLUSTER1和CLUSTER2毒株在V3區(qū)的氨基酸序列主要存在4個特征性氨基酸位點，分別位于第13、18、19和32位。其中第18位氨基酸位于頂端四肽，第13、18和19位氨基酸存在電荷差異，主要表現(xiàn)為CLUSTER1為帶正電荷，而CLUSTER2為帶負電荷。這些氨基酸電荷的差異會引起蛋白空間構象的不同，從而直接影響病毒的生物學性質。與我國其他地區(qū)MSM中流行的CRF01_AE亞型毒株比較后發(fā)現(xiàn)，CLUSTER1毒株與其在這幾個位點上的特征性氨基酸組成更為類似。因此，推測CLUSTER1和CLUSTER2毒株可能具有不同的生物學特性，而CLUSTER1毒株與國內其他地區(qū)MSM中流行的毒株有更相似的生物學特征。二、MSM中HIV1急性感染者代表性病毒株的選取及其病毒生物學特性研究（一）代表性毒株的選擇選取CLUSTER1中的急性感染者為研究對象。結合病毒RNA、抗體WB檢測結果及流行病學資料，對基因序列分析后，選擇資料完整的患者320008為研究對象進行下一步驗證。獲得其感染第30天（第一點，F(xiàn)IEBIGⅣ期，僅有血漿樣本）、第47天（第二點，F(xiàn)IEBIGⅥ期，保留血漿和PBMC樣本）和第54天（第三點，F(xiàn)IEBIGⅥ期，保留血漿和PBMC樣本）血漿病毒RNA進行近全長序列擴增。比較后發(fā)現(xiàn)在第二、三點與第一點高度相似，但存在3個可遺傳的有義突變，分別位于GAG基因P17末端423，TAT基因第一外顯子末端70，ENV基因C4起始位置2，而且第二點與第三點病毒相比擁有較少的G＞A超突變和GAG區(qū)的變異，意味著第三點病毒受宿主免疫壓力的影響較大，從而推測第二點病毒應是更接近建立感染的早期傳播毒株。利用SGA方法擴增第二點樣本的近全長序列，分別比較其5和3AMPLICON的序列后發(fā)現(xiàn)，序列間核苷酸變異率較小，組內遺傳距離均為0001±0000。由此可知，第二點5和3SGAAMPLICON的遺傳同質性均較高，因此推斷第二點病毒還是單一的毒株，受宿主免疫壓力影響較小，仍具有建立感染的早期傳播毒株的特征且與現(xiàn)有CRF01_AE亞型感染性分子克隆的基因距離較遠，推測這些感染性分子克隆與我國MSM人群中流行的CRF01AE亞型的早期傳播毒株在某些生物學特性上可能會存在差異，并不適用于研究我國MSM人群的HIV1主要流行毒株的生物學特征及致病機理等基礎研究。（二）早期傳播毒株原代病毒的分離及其病毒生物學特性利用PBMC共培養(yǎng)法，我們成功分離了前期選取的患者320008感染第47天的原代病毒08ISO，其能感染TZMB1和PBMC細胞，并可在其中復制，且復制水平較高，以CCR5作為輔助受體，具有巨噬細胞嗜性的特性，是具有早期傳播毒株表型特征的原代病毒。綜上，我們獲得了一株具有高度遺傳同質性、有感染和傳播能力的代表性毒株，其在基因型和表型上都具備早期傳播毒株的特征。三、CRF01AE亞型HIV1早期傳播毒株感染性分子克隆的構建及其生物學特征的初步研究（一）320008毒株全基因組克隆的構建與鑒定320008原代病毒08ISO體外培養(yǎng)后，提取前病毒基因組DNA，兩段法分別擴增5半分子5LTRVIF15066NT和3半分子VIF3LTR，49009719NT后，分別克隆入TOPOPCRXL載體構建成半分子克隆，再利用NDEⅠ酶切位點連接為全基因組克隆。其基因序列結果顯示，全基因組克隆包括完整的HIV1結構，且無移碼突變和終止密碼。經(jīng)NJ系統(tǒng)樹分析表明，其與病毒RNA近全長的共享序列高度同源，且與前期研究中CRF01AECLUSTER1中毒株聚集成簇，遠離現(xiàn)有的來源于慢性經(jīng)異性傳播CRF01AE亞型感染者的感染性分子克隆。（二）320008衍生病毒的產(chǎn)生及其HIV1主要結構蛋白的表達情況全基因組克隆轉染293T細胞48小時后，收集上清檢測其HIV1P24抗原，均在1105PGML以上，說明有衍生病毒產(chǎn)生。利用WESTERNBLOTTING技術檢測轉染后的293T細胞，其結果顯示有GP160，GP120，GP41，P64，P53，P24和P17等蛋白表達，提示我們構建的全基因組克隆可以在細胞內轉錄并翻譯出HIV1的結構和功能蛋白，并被細胞蛋白酶很好地切割，具備了組裝HIV1_病毒顆粒的條件，是具有感染性的全基因組克隆即感染性分子克隆08IMC。（三）感染性分子克隆生物學特性的研究感染性分子克隆08IMC轉染293T細胞后，收獲的衍生病毒能感染TZMB1和PBMC細胞，并可在其中復制，但衍生病毒的復制水平顯著低于其原代病毒08ISO與原代病毒08ISO的情況一致，衍生病毒也以R5作為輔助受體，具有巨噬細胞嗜性的特性，。因此，我們獲得的感染性分子克隆08IMC也具有早期傳播毒株的特征。結論1CRF01AE是遼寧省MSM人群中主要流行的HIV1亞型，主要分為兩大簇，其中近年來增加較快的CLUSTER1與CLUSTER2在V3區(qū)氨基酸特征上存在顯著差異，而與我國其他地區(qū)MSM中流行的毒株相似，基因距離較近，具有較近的親緣關系。2篩選CLUSTER1毒株，選取一例感染47天處于FIEBIGⅥ期的感染者320008分離其原代病毒08ISO并檢測其病毒生物學特性，結果顯示其病毒RNA具有較高的遺傳同質性，是早期感染的單一毒株原代病毒08ISO可以利用CCR5輔助受體感染TZMB1細胞和PBMC，并可在其中復制，且復制水平較高。由此可以確定原代病毒08ISO是目前在我國MSM人群中主要流行的CRF01_AE亞型毒株中具有代表性的有感染和傳播能力的早期傳播毒株。3利用08ISO構建的感染性分子克隆08IMC與目前我國MSM人群中主要流行的CRF01AE毒株遺傳距離接近，同源性較高，有較近的親緣關系其衍生病毒與原代病毒生物學性質相似，因此可以認為感染性分子克隆08IMC是目前我國MSM中主要流行的CRF01AE早期傳播毒株的感染性分子克隆。

簡介：本研究利用共聚焦顯微鏡觀察了未成熟樹突狀細胞對凋亡腫瘤細胞的攝取，采用流式細胞術和3HTDR摻入實驗研究了CD40和TNFR信號對凋亡腫瘤細胞負載的樹突狀細胞表型的促成熟作用和促T細胞增殖效應，采用胞內染色、流式細胞術和ELISA探討了CD40配基化的腫瘤特異性樹突狀細胞對TH細胞的極化作用，結果表明，凋亡腫瘤細胞負載的樹突狀細胞在CD40信號的作用下能進一步成熟，分化成為功能性的腫瘤特異性樹突狀細胞，其在體外能有效介導TH1效應細胞的分化，并且此極化TH潛能和其表面B7H3分子的高表達相關。本研究結果還提示采用CD40信號激發(fā)的腫瘤特異性樹突狀細胞有望成為腫瘤免疫治療的新手段。

簡介：HMGB1表達下調表達下調對胃癌細胞生物學功對胃癌細胞生物學功能的影響及能的影響及初步初步分子分子機制探討機制探討李人立培養(yǎng)類別全日制學位類型學術學位一級學科專業(yè)類臨床醫(yī)學二級學科專業(yè)外科學（普外）研究方向胃癌機制研究指導教師包國強副教授（副主任醫(yī)師）培養(yǎng)單位唐都醫(yī)院普外科二O一五年五月分類號Q28UDC601密級公開第四軍醫(yī)大學碩士學位論文目錄縮略語表1中文摘要3英文摘要5前言8文獻回顧9正文19實驗一HMGB1表達下調胃癌細胞系的建立及鑒定191材料1911細胞系與質粒1912主要試劑和儀器192方法2121HMGB1基因RNAI慢病毒載體的構建2122慢病毒小量包裝及其滴度測定2323胃癌細胞慢病毒感染2424RTPCR內源篩選有效靶點2625WESTERNBLOT實驗檢測HMGB1蛋白表達273結果2731慢病毒干擾載體GV155HMGB1陽性克隆PCR鑒定2732慢病毒干擾載體GV155HMGB1的DNA測序結果2833慢病毒包裝與病毒滴度測定2834RTPCR內源篩靶結果2935WESTERNBLOT驗證結果304討論30實驗二HMGB1表達下調對胃癌細胞生物學功能的影響321材料32

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