ALC1基因在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:隨著生活環(huán)境和飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率以及死亡人數(shù)呈不斷上升趨勢(shì)。因其早期癥狀不明顯，在已確診患者中進(jìn)展期占大多數(shù)，是對(duì)生命威脅程度較大的消化道腫瘤之一。由于結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，其中涉及一系列基因的激活或失活，因此深入理解結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制將有助于進(jìn)一步提高早期診斷率、提供新的治療手段和改善預(yù)后。近年來(lái)細(xì)胞遺傳學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)眾多惡性上皮性腫瘤中存在染色體1q或1q部分

2、區(qū)段的高頻擴(kuò)增。2008年Guan等應(yīng)用染色體微切割及雜交流選擇技術(shù)，從肝癌細(xì)胞的1q21.1高擴(kuò)增區(qū)段克隆了一個(gè)新的候選癌基因:AmplifiedinLiverCancer1(ALC1)。由于結(jié)直腸癌中也存在1q或1q部分區(qū)段的高頻擴(kuò)增，那么在結(jié)直腸癌中是否也存在著ALC1基因的擴(kuò)增與異常表達(dá)？其是否與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)？能否成為評(píng)估腫瘤預(yù)后的新分子標(biāo)記物？目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本課題旨在探索ALC1基因在結(jié)直腸癌中的擴(kuò)

3、增與表達(dá)情況及其臨床病理學(xué)意義;同時(shí)研究ALC1的異常表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、遷移和侵襲及凋亡的相關(guān)性，以期闡明ALC1在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，并且進(jìn)一步探尋其作用機(jī)制。
　　材料和方法:
　　應(yīng)用免疫組化、定量RT-PCR、免疫印跡和熒光原位雜交的方法，檢測(cè)ALC1基因在86例原發(fā)性結(jié)直腸癌中的表達(dá)與擴(kuò)增，并結(jié)合腫瘤的臨床病理學(xué)特點(diǎn)和預(yù)后資料，分析它們之間的相關(guān)性。在ALC1基因功能的體外研究中，我們構(gòu)建pcD

4、NA3.1(+)-ALC1的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116并篩選穩(wěn)定表達(dá)的克隆，觀察ALC1對(duì)SW1116結(jié)腸癌細(xì)胞體外增殖能力、細(xì)胞周期、凋亡、遷移侵襲能力及體內(nèi)成瘤能力的影響。為研究ALC1過(guò)表達(dá)后對(duì)下游基因的調(diào)控，我們選用Affymetrix人全基因組芯片U133plus2.0進(jìn)行cDNA微陣列實(shí)驗(yàn)，對(duì)ALC1高表達(dá)和空載體對(duì)照SW1116細(xì)胞進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。
　　結(jié)果:
　　在86例原發(fā)性結(jié)直腸癌中61.

5、6％的患者出現(xiàn)ALC1蛋白的過(guò)度表達(dá);而全部的癌旁和正常腸粘膜組織未發(fā)現(xiàn)ALC1蛋白的過(guò)度表達(dá)。ALC1蛋白表達(dá)與較大的腫瘤直徑、較深的浸潤(rùn)程度和較高的組織學(xué)分級(jí)均有顯著的相關(guān)性(P值均＜0.05)。在49例成功進(jìn)行FISH檢測(cè)和分析的結(jié)直腸癌病例中，有9例檢測(cè)到ALC1基因的擴(kuò)增，其中8例存在ALC1蛋白的過(guò)度表達(dá)，明顯高于ALC1基因未擴(kuò)增病例中40％(16/40)的蛋白過(guò)度表達(dá)率(P=0.011)。生存分析顯示，ALC1蛋白表達(dá)陽(yáng)

6、性的患者預(yù)后明顯差于表達(dá)陰性的患者;在無(wú)病生存期(DFS)中表現(xiàn)得尤為顯著(P=0.003)而兩組患者的總生存期(OS)則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P=0.14)。
　　定量RT-PCR和蛋白印跡結(jié)果均顯示在6株結(jié)直腸癌細(xì)胞株中ALC1的表達(dá)程度不同，其表達(dá)水平在SW480細(xì)胞中較高而在SW1116細(xì)胞中則相對(duì)較低;pcDNA3.1-ALC1轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞后則能顯著提高其表達(dá)45.5土4.2倍。體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上調(diào)ALC1的

7、表達(dá)能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移(ALC1組和pcDNA3.1穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)分別是152±18個(gè)和58±8個(gè)細(xì)胞)、侵襲(ALC1組和pcDNA3.1組穿過(guò)小室底內(nèi)膜的細(xì)胞數(shù)分別是51±6個(gè)和18±3個(gè)細(xì)胞)及裸鼠體內(nèi)的成瘤能力(ALC1組和pcDNA3.1組在裸鼠皮下形成腫瘤的重量分別是1.223±0.047g和0.926±0.033g)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示ALC1轉(zhuǎn)染組與SW1116未轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組相比較，

8、細(xì)胞凋亡率顯著降低(2.3±0.6％vs.5.9±0.9％;2.3±0.6％vs.6.4±1.0％;p＜0.05)，同時(shí)增加G2/M期細(xì)胞數(shù)量(16.02±0.53％vs.6.84±0.16％，p＜0.05)，從而促進(jìn)有絲分裂。cDNA微陣列分析篩選出1786個(gè)與ALC1功能相關(guān)的基因，其中1072個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，714個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。其中Thrombospondin1(TSP-1)水平下調(diào)97％(倍數(shù)變化:0.03)，其下游的FYN、

9、cd36、C-Fos基因表達(dá)同時(shí)下調(diào)，從而造成細(xì)胞凋亡降低，腫瘤微血管生成增加。
　　結(jié)論:
　　ALC1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯增高并且其表達(dá)水平與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、組織分化程度和無(wú)病生存期均密切相關(guān);ALC1基因的擴(kuò)增可能在其蛋白過(guò)度表達(dá)中起著重要的作用。ALC1基因表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和裸鼠體內(nèi)的腫瘤形成能力;ALC1基因表達(dá)能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)增加G2/M期細(xì)胞數(shù)量，從而促進(jìn)有絲