簡(jiǎn)介：本文選擇了具有重大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益的抗乙肝病毒新藥阿德福韋酯作為研究?jī)?nèi)容。我國(guó)是慢性乙型肝炎高發(fā)區(qū)，人群中慢性乙型肝炎病毒HBV攜帶者有12億，慢性肝炎患者有3400萬(wàn)，而目前世界上公認(rèn)對(duì)慢性乙肝治療有效的抗病毒藥物干擾素和拉米夫定由于其自身的缺陷在臨床使用中受到一定的限制，許多乙肝患者得不到有效的治療，最終發(fā)展為肝硬化、肝癌直至死亡。阿德福韋酯是一個(gè)新的抗病毒藥物，到目前為止的研究表明它能減少各種慢性乙肝患者的病毒負(fù)荷，包括HBEAG陽(yáng)性和HBEAG陰性的慢性乙肝病人、代償性肝病的慢性乙肝病人和拉米夫定耐藥的慢性乙肝病人；與安慰劑相比，它能明顯改進(jìn)肝炎病人的病毒學(xué)、血清學(xué)、組織學(xué)和生化指標(biāo)；到目前為止，未檢測(cè)到阿德福韋酯耐藥變異；其安全性極好，適合于長(zhǎng)期治療。所有的研究結(jié)果都支持阿德福韋酯作為乙肝治療的一線(xiàn)藥物。因此，阿德福韋酯的研制成功，將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)慢性乙肝病人缺少有效藥物治療的現(xiàn)狀，病人應(yīng)用阿德福韋酯后不必再受病毒變異問(wèn)題的困擾，可獲得長(zhǎng)期有效的治療，對(duì)那些應(yīng)用拉米夫定后出現(xiàn)耐藥的病人有了新的選擇或補(bǔ)充治療方法，具有重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本文通過(guò)對(duì)阿德福韋酯原料藥及其片劑的臨床前研究，包括藥物的合成工藝、處方篩選、質(zhì)量研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立、包裝和穩(wěn)定性研究、藥理毒理研究，完成了阿德福韋酯由化工產(chǎn)品向安全有效、質(zhì)量可控藥物的轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)了質(zhì)的飛躍，特別是通過(guò)對(duì)結(jié)晶工藝的研究，發(fā)現(xiàn)了國(guó)外專(zhuān)利保護(hù)的四種晶型以外的阿德福韋酯新的結(jié)晶形態(tài)，有效地突破了國(guó)外專(zhuān)利封鎖，并通過(guò)申請(qǐng)專(zhuān)利使之擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)該專(zhuān)利即將授權(quán)。通過(guò)對(duì)新晶型阿德福韋酯與國(guó)外上市產(chǎn)品專(zhuān)利報(bào)道Ⅰ型阿德福韋酯理化性質(zhì)與生物活性的比較研究，證明兩種晶型的阿德福韋酯理化性質(zhì)相近、生物等效，這樣就保證了新晶型阿德福韋酯的安全性和有效性，為其進(jìn)一步的臨床研究及實(shí)現(xiàn)本土產(chǎn)品的國(guó)內(nèi)上市打下了良好的基礎(chǔ)。該項(xiàng)目于2002年12月申報(bào)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局申請(qǐng)臨床研究，并一次性地通過(guò)了國(guó)家藥品審評(píng)中心的審評(píng)，這說(shuō)明針對(duì)新晶型阿德福韋酯原料藥及其片劑進(jìn)行的藥品安全性、有效性及質(zhì)量可控性的研究得到了國(guó)家藥品審評(píng)中心的肯定，已于2003年7月取得臨床批件，臨床研究正在進(jìn)行中，預(yù)計(jì)2005年在國(guó)內(nèi)上市。

簡(jiǎn)介：【目的】研究AEDS對(duì)不同腦發(fā)育期大鼠認(rèn)知功能的影響，初步探討AEDS損害認(rèn)知功能的可能機(jī)制。【方法】以生后第8天POSMATALDAY8，P8及P15幼年WISTAR鼠為研究對(duì)象，分組予苯巴比妥PHENOBARBITAL，PB30MGKG，QD、丙戊酸鈉VALPROATESODIUM，VPA150MGKG，BID、托吡酯TOPIRAMATE，TPM40MGKG，BID連續(xù)灌胃用藥7天，對(duì)照組服用羧甲基纖維素鈉CARBOXYMETHYLCELLULOSE，CMC代替。給藥結(jié)束后將各組動(dòng)物分為兩部分，其中一半取血測(cè)定PB、VPA血藥濃度、測(cè)量腦重，并用TUNEL染色法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，電鏡觀察海馬突觸形態(tài)。免疫組化法檢測(cè)突觸素SYNAPTOPHYSIN，SYP及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BRAINDERIVEDNEUROTROPHICFACTBDNF的表達(dá)的變化。另一半實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)喂養(yǎng)，并分別于給藥結(jié)束后第7天及P60齡時(shí)予MRIS水迷宮檢測(cè)其學(xué)習(xí)記憶與空間定位能力，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)P65處死動(dòng)物，檢測(cè)腦組織內(nèi)SYP的表達(dá)。【結(jié)果】1與同期實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比，生后8天使用PB、VPA后，大鼠顳葉皮層及海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生率顯著升高P001，大鼠腦重量減低P001；海馬CA3區(qū)突觸素積分光密度INTEGRATEDOPTICALDENSITY，IOD顯著降低P001，且顳葉皮層及海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞BDNFIOD顯著降低P001。電鏡下，突觸前膜囊泡數(shù)量減少，突觸間隙增寬。MRIS水迷宮檢測(cè)，大鼠尋臺(tái)逃避潛伏期較對(duì)照組顯著延長(zhǎng)P001，穿越平臺(tái)次數(shù)較對(duì)照組顯著減少P001。隨訪至生后65天P65時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦重和海馬CA3區(qū)突觸素IOD仍顯著低于對(duì)照組P005。2生后15天服用PB、VPA的大鼠，無(wú)論其顳葉皮層及海馬CA3區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、腦重，還是海馬CA3區(qū)突觸素IOD、顳葉皮層及海馬CA3區(qū)BDNFIOD與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異，電鏡觀察突觸無(wú)明顯形態(tài)學(xué)改變。大鼠尋臺(tái)逃避潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組比較也無(wú)顯著差異。3無(wú)論是生后8天，還是15天服用TPM，與對(duì)照組相比，大鼠的顳葉皮層及海馬CA3區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、腦重、海馬CA3區(qū)突觸素IOD、顳葉皮層及海馬CA3區(qū)BDNFIOD均無(wú)顯著性差異，電鏡觀察突觸無(wú)明顯形態(tài)學(xué)改變。大鼠尋臺(tái)逃避潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組比較也無(wú)顯著差異。【結(jié)論】1在腦快速生長(zhǎng)發(fā)育期PB、VPA能夠促進(jìn)海馬及顳葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，海馬突觸生長(zhǎng)不良，減低大鼠腦重，造成認(rèn)知功能損傷。而此種腦形態(tài)與功能的損害，呈現(xiàn)不可逆性。2PB、VPA對(duì)大鼠腦發(fā)育及認(rèn)知功能損害存在敏感期，腦快速生長(zhǎng)期后，服用PB、VPA未發(fā)現(xiàn)對(duì)大鼠腦發(fā)育及功能存在明顯影響。3TPM對(duì)快速生長(zhǎng)期大腦未產(chǎn)生明顯結(jié)構(gòu)與功能異常，可以成為小年齡癲癇治療的適當(dāng)用藥。4神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)BDNF表達(dá)的變化及其影響的突觸變化在PB、VPA引起的大鼠腦發(fā)育及認(rèn)知功能異常中起重要作用。

簡(jiǎn)介：目的本項(xiàng)研究是由劉艷驕導(dǎo)師領(lǐng)導(dǎo)的課題組承擔(dān)的中國(guó)科協(xié)科普基金資助項(xiàng)目“中醫(yī)藥知識(shí)傳播中的公眾認(rèn)知度及效果評(píng)價(jià)”的一部分從理論和實(shí)際出發(fā)探索中醫(yī)藥學(xué)知識(shí)在傳播過(guò)程中所存在的問(wèn)題探討解決公眾對(duì)中醫(yī)藥知識(shí)模糊認(rèn)識(shí)的途徑以及中醫(yī)藥知識(shí)傳播方式的新方法。其中結(jié)合本專(zhuān)業(yè)還探討了公眾對(duì)中醫(yī)治療睡眠障礙的認(rèn)知度為睡眠障礙的研究提供更多的依據(jù)。了解我國(guó)公眾對(duì)中醫(yī)藥基本知識(shí)認(rèn)知的現(xiàn)狀、特征及存在問(wèn)題是建設(shè)提高我國(guó)公眾對(duì)中醫(yī)認(rèn)知度的前提并在現(xiàn)狀分析的基礎(chǔ)上結(jié)合我國(guó)國(guó)情對(duì)影響我國(guó)公眾中醫(yī)藥知識(shí)認(rèn)知度的因素進(jìn)行分析總結(jié)把握各個(gè)因子的作用機(jī)理和渠道為政府決策提供建議。因此本課題的研究可以更好地協(xié)助政府和有關(guān)部門(mén)了解中國(guó)公眾對(duì)中醫(yī)藥知識(shí)的理解問(wèn)題促進(jìn)我國(guó)中醫(yī)藥知識(shí)的傳播同時(shí)也有利于更好地使用中醫(yī)藥為公眾服務(wù)。方法和內(nèi)容本項(xiàng)研究所采用的研究方法主要采用調(diào)查研究方法內(nèi)容包括網(wǎng)絡(luò)調(diào)查、現(xiàn)場(chǎng)問(wèn)卷調(diào)查的方法。本調(diào)查主要采取問(wèn)卷的形式以封閉型問(wèn)卷類(lèi)型為主。具體方法主要包括1采用隨機(jī)抽樣調(diào)查方法。邀請(qǐng)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局城市調(diào)查大隊(duì)協(xié)助進(jìn)行統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)以使隨機(jī)抽樣調(diào)查更加準(zhǔn)確和科學(xué)。2按照科研的需要撰寫(xiě)調(diào)查策劃書(shū)并請(qǐng)有關(guān)部門(mén)的專(zhuān)家審閱確立調(diào)查的內(nèi)容進(jìn)行調(diào)查問(wèn)卷的設(shè)計(jì)。3利用現(xiàn)有條件查閱古代及現(xiàn)代文獻(xiàn)按照文獻(xiàn)學(xué)研究方法對(duì)古代醫(yī)家傳播中醫(yī)藥知識(shí)的方式、方法進(jìn)行研究以吸取他們的智慧和經(jīng)驗(yàn)。4根據(jù)全民科學(xué)素養(yǎng)調(diào)查的經(jīng)驗(yàn)采用媒體報(bào)刊或網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行公開(kāi)的調(diào)查問(wèn)卷并對(duì)踴躍參與者由公司給予適當(dāng)?shù)莫?jiǎng)勵(lì)。5用EXCEL、SPSS13O進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析。本課題主要包括現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查和睡眠障礙網(wǎng)絡(luò)調(diào)查兩部分。其中現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查包括六個(gè)部分基礎(chǔ)數(shù)據(jù)中醫(yī)藥基礎(chǔ)知識(shí)中醫(yī)藥知識(shí)的傳播睡眠障礙的中醫(yī)治療中醫(yī)學(xué)與社會(huì)及效果評(píng)價(jià)。睡眠障礙網(wǎng)絡(luò)調(diào)查包括兩個(gè)部分一般情況和常見(jiàn)睡眠障礙知識(shí)的了解程度結(jié)果現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查共收集問(wèn)卷896份剔除退出及無(wú)效問(wèn)卷121份1350％故共收集有效問(wèn)卷775份。通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)大多數(shù)被調(diào)查人對(duì)中醫(yī)理論的認(rèn)識(shí)還是正確的對(duì)中醫(yī)事業(yè)的發(fā)展也比較支持。睡眠障礙網(wǎng)絡(luò)調(diào)查共有1317人參與時(shí)間持續(xù)三個(gè)月。從調(diào)查結(jié)果可以看出大多數(shù)人對(duì)睡眠障礙并沒(méi)有足夠的了解。對(duì)于出現(xiàn)睡眠障礙后進(jìn)行過(guò)中醫(yī)治療的患者大多數(shù)人都對(duì)中醫(yī)治療效果表示肯定。結(jié)論從調(diào)查的結(jié)果看中醫(yī)學(xué)還是有發(fā)展的。中醫(yī)要發(fā)展只能靠療效同時(shí)也需要政府的支持和社會(huì)的認(rèn)可。通過(guò)睡眠障礙網(wǎng)絡(luò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)人群中對(duì)中醫(yī)治療睡眠障礙的看法還存在一定的差距。人群中在出現(xiàn)睡眠障礙時(shí)多數(shù)人選擇的是忍耐通過(guò)對(duì)服用中藥的調(diào)查看出人們對(duì)中醫(yī)睡眠醫(yī)學(xué)的理論了解的不很多。人們對(duì)中醫(yī)藥治療的最大感受是改善癥狀提高生存質(zhì)量。

簡(jiǎn)介：目的探討構(gòu)建攜帶人堿性成纖維生長(zhǎng)因子BFGF的重組慢病毒載體方法并觀察堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后BFGF目的基因的表達(dá)情況。方法采用RTPCR擴(kuò)增的方法獲取人源性的BFGF與FGF4基因，將目的基因與載體PGCFU連接含綠色熒光蛋白GFP。產(chǎn)生PGCFUFGF4BFGF慢病毒載體。PCR篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定。通過(guò)LIPOFECTAMINE2000的介導(dǎo)把PGCFUFGF4BFGF載體，PHELPER10載體和PHELPER20載體三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞293T應(yīng)用REALTIMEPCR法鑒定和測(cè)定滴度。而后轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并檢測(cè)其表達(dá)。MTT法檢測(cè)到間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因修飾以后和未經(jīng)過(guò)基因修飾的干細(xì)胞生長(zhǎng)情況結(jié)果⑴流式細(xì)胞儀顯示體外分離培養(yǎng)的第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原表達(dá)CD11BC陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率為142％±07％，CD34陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率為13％±05％，CD44陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率978％±09％，CD90陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率969％±15％。⑵PCR鑒定證實(shí)重組慢病毒有人FGF4信號(hào)肽人BFGF，病毒滴度為200E9TUML。⑶轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，行RTPCR檢測(cè)到BFGF基因轉(zhuǎn)入干細(xì)胞內(nèi)，其大小約500BP。⑷在熒光顯微鏡下，觀察到轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)；通過(guò)WESTERNBLOT檢測(cè)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以觀察到36～55KDR之間有明顯表達(dá)，與FGF4BFGFGFP融合蛋白2128KDR49KDR基本吻合。備注構(gòu)建的PGCFUFGF4BFGF基因插入片斷大小549BP綜上基本判斷FGF4BFGF表達(dá)正常。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染BFGF的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度顯著高于空白對(duì)照。⑸MTT法檢測(cè)到間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因修飾以后和未經(jīng)過(guò)基因修飾的干細(xì)胞生長(zhǎng)情況對(duì)比，基因修飾后的目的細(xì)胞明顯優(yōu)于未經(jīng)修飾的干細(xì)胞。結(jié)論成功構(gòu)建的攜帶人成堿纖維生長(zhǎng)因子的慢病毒載體能在293T細(xì)胞擴(kuò)增獲得足夠高的病毒滴度，并轉(zhuǎn)染入大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)檢測(cè)可以有效的表達(dá)?？梢詾橄乱徊交蛑委煷笫笙轮毖峁┖芎玫幕A(chǔ)。

簡(jiǎn)介：蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文植物雌激素對(duì)去卵巢血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能和海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響姓名陳明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)人體解剖與組織胚胎學(xué)指導(dǎo)教師宋焱峰侯一平20051201蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文察去卵巢VD大鼠各組海馬膽堿能神經(jīng)元的數(shù)目。結(jié)果與OVX組相比，OVXEST組及OVXPHY組的大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元數(shù)目明顯升高PO．05。結(jié)論1去卵巢VD大鼠經(jīng)普通食物喂養(yǎng)后大腦海馬結(jié)構(gòu)CHAT表達(dá)下降，同時(shí)伴隨空間記憶能力表達(dá)下降；2去卵巢VD大鼠經(jīng)普食添加雌激素或植物雌激素飼養(yǎng)后，大腦空間記憶能力及海馬結(jié)構(gòu)CHAT的表達(dá)和未去除卵巢VD大鼠相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3植物雌激素具有雌激素樣作用，能增強(qiáng)大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元的表達(dá)，提高記憶、預(yù)防和治療VD疾病的發(fā)生。關(guān)鍵詞植物雌激素；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶；海馬；去卵巢大鼠；血管性癡呆II

簡(jiǎn)介：近年來(lái)，性傳播疾病STD逐年增多，而其中尖銳濕疣CA的發(fā)病率占性病構(gòu)成比的2473％，居第二位。人乳頭瘤病毒HPV型別眾多，而尖銳濕疣主要是由HPV11型引起的。HPV基因組中的晚期區(qū)基因L1編碼主要衣殼蛋白，具有穩(wěn)定的免疫原性。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，L1基因表達(dá)后可自行組裝成不含病毒DNA的病毒樣顆粒VLPS。VLPS具有與天然病毒相似的空間構(gòu)象、免疫特性和生物學(xué)活性，因此以LL為保護(hù)性抗原構(gòu)建的疫苗在預(yù)防HPV感染方面發(fā)揮著重要的作用。本研究首先從天津地區(qū)尖銳濕疣患者新鮮組織標(biāo)本中提取HPVDNA，并用PCR方法對(duì)其進(jìn)行分型，篩選出HPV11型病毒DNA。用PCR擴(kuò)增出帶有酶切識(shí)別位點(diǎn)的HPV11L1基因片段。利用PCR產(chǎn)物兩末端帶有的單個(gè)A堿基，與帶有單個(gè)T堿基末端的PMDL8T載體借助堿基互補(bǔ)連接，構(gòu)建成質(zhì)粒PMDL8THPV11L1，并進(jìn)行了酶切鑒定以及L1基因的PCR鑒定和序列分析。從該質(zhì)粒中酶切獲取L1基因片段，并將其插入帶有相同粘性末端的表達(dá)載體質(zhì)粒PET42A構(gòu)建成表達(dá)HPV11L1蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒PET42AHPV11L1，并對(duì)其進(jìn)行了酶切以及L1基因的PCR鑒定和序列分析。最后對(duì)該重組表達(dá)質(zhì)粒PET42AHPV11L1在大腸桿菌BL21DE3中進(jìn)行了初步表達(dá)。本研究將HPV11型L1基因克隆入PET42A原核表達(dá)載體，成功構(gòu)建了PET42AHPV11L1，并在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)，為進(jìn)一步展開(kāi)HPV疫苗的研究創(chuàng)造條件。

簡(jiǎn)介：腸道病毒71型EV71屬于人類(lèi)小核糖核酸病毒科腸道病毒屬腸道病毒A種病毒，同柯薩奇病毒16型CA16一道，是引發(fā)手足口病HFMD的兩種主要病原體。雖然手足口病的臨床癥狀表現(xiàn)為輕微的發(fā)疹及發(fā)燒癥狀，但是EV71病毒的感染能夠引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)疾病，如致死性腦炎，無(wú)菌性腦膜炎，急性松弛性麻痹，而CA16病毒的感染一般不會(huì)導(dǎo)致這些疾病。EV71病毒主要感染小孩，特別是嬰幼兒，其病毒于1969年在加利福尼亞的一個(gè)患有致死性腦炎的9個(gè)月大的嬰兒中第一次分離得到的。手足口病在很多國(guó)家和地區(qū)中廣泛流行著。近年來(lái)，在馬來(lái)西亞、新加坡、臺(tái)灣、日本、韓國(guó)、越南和中國(guó)大陸等東南亞和東亞的國(guó)家和地區(qū)經(jīng)常會(huì)有手足口病的大爆發(fā)。目前由于沒(méi)有合適的疫苗和抗病毒藥物，還不能治療由EV71感染導(dǎo)致的手足口病。在EV71感染過(guò)程中會(huì)發(fā)生依賴(lài)于抗體的病毒感染增強(qiáng)現(xiàn)象，這給疫苗治療制造了一些困難?？贵w這種被動(dòng)免疫治療的藥物，也許是治療手足口病的新希望。在本實(shí)驗(yàn)中我們選用EV71HM003207病毒株，該病毒株屬于目前國(guó)內(nèi)EV71感染病例中最常見(jiàn)的病毒C4亞型。用EV71活病毒、VP1GST融合蛋白以及偶聯(lián)上血藍(lán)蛋白KLH的SP55、SP70和VP228三條中和線(xiàn)性表位肽作為三種免疫原成分免疫BALBC小鼠，而后雜交瘤細(xì)胞技術(shù)結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA，篩選到了14株強(qiáng)結(jié)合型單克隆抗體。在橫紋肌瘤細(xì)胞RD和神經(jīng)細(xì)胞SKNSH上檢測(cè)單克隆抗體的中和保護(hù)作用，結(jié)果顯示有四株單克隆抗體在RD細(xì)胞和SKNSH細(xì)胞上都表現(xiàn)出中和保護(hù)作用2B6、12B6、6G5、2G12，有兩株單克隆抗體只在SKNSH細(xì)胞中表現(xiàn)出中和保護(hù)作用7E6、7G6，而僅有一株單克隆抗體僅在RD細(xì)胞上表現(xiàn)出中和保護(hù)作用1G6。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上建立檢測(cè)抗EV71單克隆抗體的中和保護(hù)作用模型獲得的單克隆抗體可為后續(xù)人源化改造提供原材料同時(shí)篩選到不同中和保護(hù)類(lèi)型的抗體，可用于病毒致病機(jī)理的相關(guān)研究。

簡(jiǎn)介：分類(lèi)號(hào)UDC_中韻密級(jí)1734901編號(hào)～～摯CENTRALSOUTHUNIVERSITY碩士學(xué)位論文論文題目用于誘導(dǎo)多潛能性干細(xì)胞的入羊水細(xì)胞培養(yǎng)及逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝平臺(tái)的建立學(xué)科、專(zhuān)業(yè)研究生導(dǎo)師指導(dǎo)小組遺傳學(xué)高庭梁德生教授劉雄昊副教授潘乾高級(jí)實(shí)驗(yàn)師中南大學(xué)二00年六月碩士學(xué)位論文IRILLIIIRLIIIRRIRLRIIY1718578密級(jí)用于誘導(dǎo)多潛能性干細(xì)胞的人羊水細(xì)胞培養(yǎng)及逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝平臺(tái)的建立THEESTABLISHMENTOFTHEPLATFORMFORHUMANAMNIOTICFLUIDCELLCULTURINGANDRETROVIRUSPACKAGINGFORINDUCINGPLURIPOTENTSTEMCELLS作者姓名高庭學(xué)科專(zhuān)業(yè)遺傳學(xué)學(xué)院系、所國(guó)家生命科學(xué)技術(shù)與人才培養(yǎng)基地基因科學(xué)與技術(shù)產(chǎn)業(yè)化點(diǎn)導(dǎo)師梁德生教授指導(dǎo)小組劉雄昊副教授潘中南2010∞號(hào)類(lèi)分一11F

簡(jiǎn)介：本實(shí)驗(yàn)利用AAV包裝平臺(tái)RAAVHELPERFREESYSTEM，構(gòu)建攜帶人VEGF165基因的重組AAV和攜帶EGFP報(bào)告基因的重組AAV載體，并初步研究攜帶人VEGF165基因的AAV載體在對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞MESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS和心肌的表達(dá)情況，為下一步在體治療大鼠心力衰竭的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。第一部分基因重組HVEGF165腺相關(guān)病毒載體和基因重組增強(qiáng)型綠色熒光蛋白腺相關(guān)病毒載體的包裝目的應(yīng)用基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建包裝病毒用載體質(zhì)粒，并以三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法包裝HVEGF165腺相關(guān)病毒和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白ENHANCEDGREENFLUESCENCEPROTEIN，EGFP腺相關(guān)病毒。方法1質(zhì)粒PCDNA3HVEGF165質(zhì)粒用BAMHⅠ和XBAⅠ雙酶切獲得576BP的HVEGF165CDNA全長(zhǎng)片斷，電泳膠回收備用。PCMVMCS質(zhì)粒用BAMHⅠ和XBAⅠ雙酶切，膠回收開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA。HVEGF165CDNA片斷和開(kāi)環(huán)PCMVMCS定向連接，構(gòu)建過(guò)渡質(zhì)粒PCMVHVEGF165。所構(gòu)建質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化ECOLIDH5Α感受態(tài)細(xì)菌，挑取菌落克隆擴(kuò)增培養(yǎng)提取質(zhì)粒后酶切、PCR和測(cè)序等方法鑒定。測(cè)序引物上下游分別位于PCMVHVEGF165質(zhì)粒的BETAGLOBININTRON和HGHPA中，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度876BP，電泳結(jié)果和測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。2為了避免克隆過(guò)程中ITR的丟失引起病毒包裝效率下降，以NOTⅠ酶切質(zhì)粒PCMVHVEGF165和AAV載體質(zhì)粒PAAVMCS，行電泳、膠回收含PAAVITR的片斷和PCMVHVEGF165真核表達(dá)框，兩者連接構(gòu)建質(zhì)粒PAAVHVEGF165。所構(gòu)建質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化ECOLIDH5Α感受態(tài)細(xì)菌，挑取菌落克隆擴(kuò)增培養(yǎng)提取質(zhì)粒后用雙酶切、PCR和測(cè)序等方法鑒定。PCR鑒定引物上下游分別位于PAAVHVEGF165上下游LITR和RITR中，共擴(kuò)增2976BP片斷；以NOTⅠ和PSTⅠ雙酶切PAAVHVEGF165質(zhì)粒，可以切出約140BP大小的ITR片斷；測(cè)序引物同PCMVHVEGF165測(cè)序引物。3包裝病毒用質(zhì)粒PAAVEGFP構(gòu)建流程同PAAVHVEGF165。首先根據(jù)EGFP上下游序列設(shè)計(jì)引物，上游引物5’AGAGTCGACAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3’引入SALⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物5’GAGAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG3’引入BGLⅡ酶切位點(diǎn)。以質(zhì)粒PEGFPN1為模板，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出720BP兩端分別帶有SALⅠ酶切位點(diǎn)和BGLⅡ酶切位點(diǎn)的EGFP片段，SALⅠ和BGLⅡ雙酶切PCR產(chǎn)物膠回收后定向連接入用SALⅠ和BGLⅡ雙酶切的PCMVMCS開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA中，獲得PCMVEGFP質(zhì)粒，電穿孔轉(zhuǎn)化ECOLIDH5Α感受態(tài)細(xì)菌，挑取菌落克隆擴(kuò)增培養(yǎng)提取質(zhì)粒后行雙酶切、PCR和測(cè)序等方法鑒定。以NOTⅠ酶切質(zhì)粒PCMVEGFP和AAV載體質(zhì)粒PAAVMCS，行電泳后膠回收含PAAVITR的片斷和PCMVEGFP真核表達(dá)框，兩者進(jìn)行連接，構(gòu)建質(zhì)粒PAAVEGFP。所構(gòu)建質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化ECOLIDH5Α感受態(tài)細(xì)菌，挑取菌落克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后PCR產(chǎn)物電泳、酶切和測(cè)序鑒定4培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，待HEK293細(xì)胞長(zhǎng)至8090％融和，取PAAVHVEGF165或PAAVEGFP、PRC和PHELPER電轉(zhuǎn)化共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝RAAVHVEGF165或RAAVEGFP，取電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)72小時(shí)后的HEK293細(xì)胞進(jìn)行氯仿處理NACL沉淀氯仿抽提3個(gè)步驟，分離濃縮和純化RAAV，純化后RAAV通過(guò)AVSACHTMELISA法測(cè)定RAAV顆粒滴度，用SDS聚丙烯酰胺凝膠SDSPAGE電泳考馬斯亮藍(lán)染色觀察檢測(cè)RAAV的衣殼蛋白，將純化后的RAAV病毒樣本磷戊酸負(fù)染電鏡下觀察。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)利用基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建PCMVHVEGF165和PCMVEGFP過(guò)渡質(zhì)粒，然后再克隆入AAV載體質(zhì)粒構(gòu)建PAAVHVEGF165和PAAVEGFP，目的是為了防止PAAV質(zhì)粒中的ITR在操作過(guò)程中的丟失而影響病毒包裝效率。所有質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果、酶切結(jié)果和測(cè)序結(jié)果正確無(wú)誤，并保證了PAAVHVEGF165和PAAVEGFP質(zhì)粒中ITR的存在。應(yīng)用電穿孔方法三個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，分離純化后獲得高滴度和純度的RAAVHVEGF165和RAAVEGFP。包裝純化后獲得病毒滴度可達(dá)到21011，SDSPAGE電泳考馬斯亮藍(lán)染色可見(jiàn)3條特征性AAV衣殼蛋白條帶，電鏡觀察病毒顆粒均勻，病毒大小20～25NM，呈多面體形態(tài)。重組AAV載體包裝成功，為后繼體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞和乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定目的建立大鼠MSCS和心肌細(xì)胞的培養(yǎng)和純化條件。方法1MSCS的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增無(wú)菌條件下將4只46周雄性WISTAR大鼠120150克股骨骨髓腔沖洗液用培養(yǎng)液洗滌2次后，小心吹打成單細(xì)胞懸液，以4105CM2接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，同時(shí)加入100UML青霉素及100ΜGML鏈霉素，于37℃，5％CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用倒置顯微鏡逐日進(jìn)行觀察。接種72小時(shí)后換液，去除懸浮的造血干細(xì)胞及血細(xì)胞，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每三天換液一次。2乳鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取15只出生后13天的WISTAR大鼠，斷頸處死，在裝有75％酒精的燒杯中浸泡5分鐘消毒，在超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌條件下取出大鼠心臟，放在裝有無(wú)菌1PBS的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用在無(wú)菌1PBS反復(fù)沖洗后，用眼科剪小心將心臟剪成≤1MM3的碎塊，用0125％的胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化，去掉首次消化的上清，收集后面消化的上清，直至心臟碎塊呈現(xiàn)白色纖維狀，用10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，用吸管將細(xì)胞培養(yǎng)液吹打均勻，加入終濃度為100UML青霉素及100ΜGML鏈霉素后，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。放入37℃，5％CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)90分鐘后差速貼壁，吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，以3105細(xì)胞ML接種于新的培養(yǎng)瓶中，同時(shí)加入BRDU至01MMOLL，12小時(shí)后更換培養(yǎng)液。以后，每隔3天換液一次。培養(yǎng)34天后，細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3應(yīng)用HE染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果1培養(yǎng)出大鼠MSCS，對(duì)第3代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，95％以上為大鼠MSCS。2培養(yǎng)出乳鼠心肌細(xì)胞，95％為乳鼠心肌細(xì)胞。為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了細(xì)胞基礎(chǔ)。第三部分基因重組野生型HVEGF165腺相關(guān)病毒載體在間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究目的利用攜帶HVEGF165的基因重組AAV轉(zhuǎn)染MSCS和心肌細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，觀察其在這兩種細(xì)胞的表達(dá)情況。方法1體外培養(yǎng)大鼠MSCS和乳鼠心肌細(xì)胞方法同前。2以不同劑量RAAVEGFP1104、1105、1106、1107、2106VPCELL轉(zhuǎn)染大鼠MSCS和乳鼠心肌細(xì)胞96小時(shí)后用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白情況。3RAAVHVEGF165以1107VPCELL轉(zhuǎn)染MSCS，以1106VPCELL轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞，用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定第4、7、10天的培養(yǎng)上清中的VEGF濃度。結(jié)果1RAAVEGFP轉(zhuǎn)染大鼠MSCS和乳鼠心肌細(xì)胞后96小時(shí)熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，以不同劑量1104、1105、1106、1107、2106VPCELL感染細(xì)胞后可見(jiàn)熒光細(xì)胞數(shù)比例MSCS為3％，29％，38％，53％，57％；乳鼠心肌為7％，33％，55％，57％，59％。RAAVEGFP在大鼠MSCS和乳鼠心肌細(xì)胞中可以表達(dá)攜帶的外源基因EGFP。3以1107VPCELL轉(zhuǎn)染大鼠MSCS和以1106VPCELL轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞后，分別在第4、7、10天檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的VEGF濃度，均呈逐漸升高趨勢(shì)，并且顯著高于空病毒對(duì)照組和未感染組，表明構(gòu)建的重組AAV可以有效的轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞，并且穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建HVEGF165腺相關(guān)病毒和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白腺相關(guān)病毒，轉(zhuǎn)染大鼠MSCS和乳鼠心肌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)表明，重組AAV在兩種細(xì)胞內(nèi)可以持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)VEGF蛋白，為下一步體外實(shí)驗(yàn)治療大鼠心力衰竭的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文溶瘤病毒對(duì)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用姓名周瑋申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師何超20070401浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院2007屆碩士學(xué)位論文【結(jié)果】1、腺病毒體外復(fù)制能力的測(cè)定用AD／HTERTGFP．E1及AD／CMVGFP感染DLDI細(xì)胞48H后，在光鏡下見(jiàn)AD／HTERTGFP．E1感染的DLDI細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)CYTOPATHICEFFECTCPE，在熒光顯微鏡下觀察到有明顯的GFP表達(dá)，感染了AD／CMUGFP的DLDL細(xì)胞中也可見(jiàn)GFP表達(dá)，但細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，而感染這兩種病毒的正常人成纖維細(xì)胞NORMALHUMANFIBROBLAST，NHFB細(xì)胞未見(jiàn)任何CPE且僅見(jiàn)極少量的GFP表達(dá)；一周后取以上細(xì)胞裂解液感染DLDL細(xì)胞，結(jié)果顯示用感染AD／HTERTGFP．E1的DLDL裂解液再次感染48H后仍可見(jiàn)明顯的CPE及GFP表達(dá)，而其他的細(xì)胞裂解液均未造成類(lèi)似的效果。對(duì)上述裂解液進(jìn)行TCID50測(cè)定后結(jié)果表明DLDL細(xì)胞感染AD／HTERTGFP．E1的裂解液后病毒滴度明顯高于感染AD／CMVGFP的裂解液，而在NHFB細(xì)胞分別感染上述兩種病毒的裂解液后病毒滴度無(wú)明顯差異。2、溶瘤病毒對(duì)大腸癌細(xì)胞的體外殺傷作用選擇不同滴度的病毒感染正常細(xì)胞NI王FB及大腸癌細(xì)胞DLDL、HCT8、LOVO、SWLL6、HCTLL6，5天后MTT法測(cè)定其細(xì)胞活力，結(jié)果表明AD／HTERTGFP．E1對(duì)NHFB沒(méi)有殺傷作用，而對(duì)大腸癌細(xì)胞均有明顯的殺傷作用，而且殺傷作用與病毒濃度存在劑量依賴(lài)關(guān)系，AD／CMVG】砷對(duì)以上腫瘤細(xì)胞都無(wú)明顯的抑制作用；用250M01的兩種病毒分別感染LOVO和NHFB后，在第3、5、7、9天測(cè)定細(xì)胞活力，結(jié)果顯示AD／HTERTGFP．E1對(duì)LOVO的殺傷作用隨作用時(shí)間增加而增強(qiáng)，而N既馮細(xì)胞的相對(duì)活力與感染時(shí)間不存在相關(guān)性；細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)結(jié)果也顯示AD，HTERTGFP．EL能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成，該抑制作用存在劑量依賴(lài)關(guān)系。3、凋亡檢測(cè)分別用500MOI的AD，HTERTGFP。E1及AD／CM、，GFP感染DLDL細(xì)胞48小時(shí)后用原位細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行凋亡檢測(cè)，結(jié)果顯示AD／HTERTGFP．E1作用后細(xì)胞凋亡率較AD／CMVGFP及PBS處理后明顯增加，細(xì)胞計(jì)數(shù)后的結(jié)果顯示PBS組、AD／CMV．GFP組、AD／HTERL二GFP．E1組的凋亡率為分別為1．44±0．15％、1．75±0．47％、10．75±1．24％，AD／HTERL二GFP，E1所引起的凋亡率顯著高于其他兩個(gè)對(duì)照組PO．01?！窘Y(jié)論】1、溶瘤腺病毒AD／HTERTGFPE1能夠選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并且能夠在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持較高的病毒滴度；2、AD／HTERTGFPE1能夠選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)人正常纖維細(xì)胞都沒(méi)有毒性作用；3、溶瘤病毒殺傷腫瘤細(xì)．2．

簡(jiǎn)介：全文分為六部分第一部分含CDUPRT融合基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與病毒包裝目的建立含CDUPRT融合基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，包裝含目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。方法根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體PLXSN的多克隆位點(diǎn)及PF5CDUPRT質(zhì)粒上CDUPRT的基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物，在引物的5’端分別引入ECⅠ和BAMHⅠ酶切位點(diǎn)，采用常規(guī)PCR從PF5CDUPRT中擴(kuò)增出CDUPRT融合基因，經(jīng)核酸序列測(cè)定正確后，分別克隆進(jìn)入PLXSN和LZRSPBMNZ。經(jīng)雙酶切鑒定無(wú)誤后，轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PT67和PHEONIX，擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，收集上清，獲得重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。結(jié)論成功構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體LZRSCDUPRT和PLXSNCDUPRT，收獲含CDUPRT基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。第二部分穩(wěn)定表達(dá)CDUPRT的C6細(xì)胞株的建立與鑒定目的建立能穩(wěn)定表達(dá)CDUPRT的C修飾細(xì)胞株，為CDUPRT聯(lián)合基因治療建立研究平臺(tái)。方法以含重組質(zhì)粒PLXSNCDUPRT和空質(zhì)粒PLXSN的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒分別轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞，加入終濃度為8ΜGML的聚凝胺輔助病毒轉(zhuǎn)染，設(shè)立無(wú)病毒轉(zhuǎn)染的C6細(xì)胞對(duì)照組，轉(zhuǎn)染時(shí)32℃1000G離心30分鐘以提高病毒轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)液，24小時(shí)重復(fù)轉(zhuǎn)染一次，末次轉(zhuǎn)染后48小時(shí)加入終濃度為200ΜGML的G418，篩選14天。篩選14天后對(duì)抗性細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)液10％FCSRPML1640，所獲抗性細(xì)胞分別命名為C6CDUPRT和C6PLXSN，電泳驗(yàn)證各細(xì)胞導(dǎo)入基因，并比較C6CDUPRT和原C6的生物學(xué)特性。結(jié)論成功地通過(guò)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的介導(dǎo)將目的基因CDUPRT轉(zhuǎn)導(dǎo)至大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6中，經(jīng)傳代培養(yǎng)鑒定證明目的基因獲得穩(wěn)定有效表達(dá)，C6CDUPRT細(xì)胞株傳代等生物學(xué)特性與原代細(xì)胞C6無(wú)差異。第三部分CDUPRT5FC基因治療方案對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的殺傷作用及殺傷機(jī)理的研究目的觀察CDUPRT5FC基因治療方案對(duì)修飾C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，并且探討可能的殺傷機(jī)理。方法設(shè)C6CDUPRT為實(shí)驗(yàn)組，C6、C6PLXSN細(xì)胞為對(duì)照組，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入5FC終濃度分別為0、01、1、10、100、1000GMOLL，用MTT法測(cè)定5FC對(duì)各組腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，免疫組化檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白FAS、FASL及BCL2的表達(dá)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例及電鏡觀察等方面來(lái)研究腫瘤細(xì)胞殺傷情況。結(jié)論CDUPRT5FC系統(tǒng)在體外對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明顯的抑制和殺傷作用，其殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的機(jī)制可能與凋亡有關(guān)，而且可能與FAS、FASL及BCL2誘導(dǎo)的凋亡有關(guān)。第四部分5FC對(duì)裸鼠接種C6CDUPRT腫瘤的治療作用目的觀察CDUPRT5FC基因治療系統(tǒng)對(duì)裸鼠皮下膠質(zhì)瘤的治療效果。方法裸鼠皮下種植C6CDUPRT、C6PLXSN及C6細(xì)胞7天后腹腔注射5FC或PBS液，比較裸鼠生存期及腫瘤大小，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例，電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)論CDUPRT5FC基因治療方案對(duì)裸鼠皮下膠質(zhì)瘤有明顯的殺傷和抑制作用，CDUPRT5FC對(duì)膠質(zhì)瘤的殺傷作用有凋亡機(jī)制的參與。第五部分CDUPRT5FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤治療作用的實(shí)驗(yàn)研究目的以大鼠顱內(nèi)腦膠質(zhì)瘤模型為基礎(chǔ)，觀察CDUPRT5FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，以正確評(píng)價(jià)CDUPRT5FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)對(duì)顱內(nèi)腦膠質(zhì)瘤的治療作用。方法應(yīng)用立體定向技術(shù)種植C6CDUPRT細(xì)胞至SD大鼠尾狀核，建立顱內(nèi)膠質(zhì)瘤荷瘤鼠模型，設(shè)立C6PLXSN和C6細(xì)胞為對(duì)照組，應(yīng)用5FC腹腔注射治療，觀察腫瘤大小、大鼠生存期、電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡指標(biāo)的變化。結(jié)論CDIYPRT5FC聯(lián)合基因治療對(duì)大鼠顱內(nèi)腦膠質(zhì)瘤有明顯的抑制和殺傷作用，其機(jī)理與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。第六部分CDUPRT5FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)藥代動(dòng)力學(xué)及旁觀者效應(yīng)和作用機(jī)理的研究目的在體外和體內(nèi)水平直接觀察C6CDUPRT細(xì)胞內(nèi)CDLYPRT雙基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)5FC作用的藥代動(dòng)力學(xué)，并研究CDUPRT5FC基因治療系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)和相關(guān)機(jī)理。建立一種無(wú)創(chuàng)、動(dòng)態(tài)、定量的基因治療觀測(cè)系統(tǒng)。方法C6和C6CDUPRT細(xì)胞株均用含10％FCS小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞附壁后更換培養(yǎng)液，同時(shí)加入終濃度為1000ΜMOLL5FC繼續(xù)培養(yǎng)24后終止培養(yǎng)，用核磁共振質(zhì)譜法MRS測(cè)定F的磁共振磁譜FMRS變化，分別檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)混合成分、細(xì)胞和細(xì)胞外培養(yǎng)液中氟化物含量。使用FMRS質(zhì)子掃描對(duì)荷瘤鼠顱內(nèi)腫瘤進(jìn)行體內(nèi)5FC藥代動(dòng)力學(xué)的測(cè)定。將C6CDUPRT及未轉(zhuǎn)染基因的C6細(xì)胞按照不同比例混和，C6CDUPRT細(xì)胞所占比例分別為0％、10％、25％、50％、75％、100％。用含終濃度為1000GMOLL5FC的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)4天，MTT法檢測(cè)OD值計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，進(jìn)一步計(jì)算細(xì)胞生存率，繪制細(xì)胞生存曲線(xiàn)，進(jìn)行旁觀者效應(yīng)的觀察。將C6CDUPRT及未轉(zhuǎn)染基因的C6細(xì)胞按照25％、75％混合細(xì)胞接種310細(xì)胞于25ML培養(yǎng)瓶，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期更換培養(yǎng)液，加入終濃度為1000ΜMOLL5FC培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行FMRS檢測(cè)。結(jié)論C6CDUPRT能夠有效表達(dá)CD、UPRT酶，高效催化5FC轉(zhuǎn)化為5FU再進(jìn)一步代謝為FNUCTD，直接發(fā)揮殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用。CDUPRT5FC基因治療系統(tǒng)最適用于5FC→5FU→FNUCTD藥代動(dòng)力學(xué)代謝過(guò)程的催化作用，兩種自殺基因療法的互補(bǔ)作用，可大大提高其實(shí)用價(jià)值。轉(zhuǎn)基因的腫瘤細(xì)胞可分泌抗腫瘤活性產(chǎn)物至細(xì)胞外，從而抑制和殺傷周?chē)哪[瘤細(xì)胞。表現(xiàn)出明顯的旁觀者效應(yīng)。FMRS掃描有可能對(duì)基因表達(dá)的所在部位和產(chǎn)物進(jìn)行無(wú)創(chuàng)、動(dòng)態(tài)和量化分析，從而對(duì)CDUPRT自殺基因治療的療效預(yù)測(cè)與評(píng)估提供客觀指標(biāo)。

簡(jiǎn)介：Y1109206分類(lèi)號(hào)TR743學(xué)校代碼103鴕學(xué)號(hào)2嘲02027福建醫(yī)科大學(xué)博士研究生畢業(yè)論文慢病毒載體介導(dǎo)血管生成素一L基匿修飾的骨髓閭一充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦梗死的實(shí)驗(yàn)研究TREATMENTOFCEREBRALINFARCTIONBYTRANSPLANTATIONOFANGIOPOIETINLGENEMODIFIEDMESENEHYMALSTEMCELLSMEDIATEDBYLENTIVIRALVECTOR所在院系研究生S學(xué)科專(zhuān)業(yè)導(dǎo)師T研究起止日期附一臨床學(xué)院藩桕齡神經(jīng)病學(xué)張志堅(jiān)教授2005年2月至2007年2月二00七年三月慢病毒載體介導(dǎo)血管生成素1基因修飾的骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦梗死的實(shí)驗(yàn)研究中文摘要腦梗死是人類(lèi)致死的三大疾病之一，其高致殘性給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。長(zhǎng)期以來(lái)，人們認(rèn)為中樞神經(jīng)損傷后引起神經(jīng)細(xì)胞不可逆的死亡，損傷的神經(jīng)元只能被膠質(zhì)細(xì)胞所填充，形成膠質(zhì)疤痕，從而喪失了神經(jīng)功能近年來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS移植治療腦梗死已成為研究熱點(diǎn)。MSCS作為種子細(xì)胞，在體內(nèi)可囪多種急性損傷后的組織遷移并定位，在局部微環(huán)境的調(diào)控下分化為不同的組織細(xì)胞。MSCS為組織結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)提供了細(xì)胞來(lái)源，且易通過(guò)血腦屏障，少有免疫排斥反應(yīng)，已成為腦缺血性疾病治療的理想靶細(xì)胞。血管生成素1ANGIOPOIETIN1，ANG1是一類(lèi)重要的血管生長(zhǎng)因子，特異性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管生成的調(diào)控過(guò)程，ANG1通過(guò)干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞之間的相互作用促進(jìn)血管生成和重塑，在缺血等病理狀態(tài)下可作為一種關(guān)鍵的血管生成調(diào)節(jié)劑。它可通過(guò)促進(jìn)缺血組織周?chē)鷤?cè)支循環(huán)形成、穩(wěn)定血管、延緩血管退化；加強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連結(jié)，維持血腦屏障的完整性；保護(hù)神經(jīng)元、抑制凋亡等多重作用機(jī)制，從而明顯增加缺血腦組織血流灌注，挽救半賠帶神經(jīng)元。ANGI已成為缺血性腦血管病基因治療新的靶點(diǎn)。慢病毒載體具有可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前基因治療中載體研究的熱點(diǎn)。因此。我們?cè)O(shè)想通過(guò)慢病毒載體的介導(dǎo)，將ANG1基因轉(zhuǎn)移至MSCS中，并將基因修飾的MSCS通過(guò)靜脈移植至大腦中動(dòng)脈栓塞模型大鼠中，利用MSCS可向急性損傷病灶趨化聚集的特點(diǎn)，期待MSCS能夠攜帶4NG1基因遷移至損傷部位，發(fā)揮A皿G1和MSCS的協(xié)同治療作用。本課題分為三部分第一部分血管生成素I基因重組慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定從GENBANK獲得ANGI基因序列，結(jié)合載體上的酶切位點(diǎn)需要。設(shè)計(jì)上下游引物，通過(guò)RTPCR方法擴(kuò)增目的基因片段，通過(guò)TA克隆篩選正確的重組體，再通過(guò)雙酶切和基因重組構(gòu)T童_ANG1重組慢病毒載體質(zhì)粒PNLANGIRES2EGFP，經(jīng)抗2

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簡(jiǎn)介：目的研究趨化因子CXCL10201AG位點(diǎn)基因多態(tài)性與EV71腦炎病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，探討EV71腦炎相關(guān)的遺傳易感因素。方法收集2012年7月至2013年7月山東青島地區(qū)EV71感染手足口病病例174例（含普通HFMD103例，腦炎71例），收集同時(shí)期同地區(qū)的健康查體兒童共227例，分別提取患兒及健康兒童外周血白細(xì)胞的基因組DNA，采用特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)PCRSSP技術(shù)檢測(cè)EV71手足口病患兒及正常對(duì)照組兒童基因組趨化因子CXCL10201AG位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果1CXCL10201AG位點(diǎn)存在三種基因型GG、GA和AA。在174例病例組中GG、GA、AA基因型頻率分別為569％、3448％、862％，在227例對(duì)照組中GG、GA、AA基因型頻率分別為5507％、3965％、528％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞005。病例組中，103例普通HFMD組GG、GA、AA基因型頻率分別為6214％、3398％、388％，71例腦炎組GG、GA、AA基因型頻率分別為5352％、3099％、1549％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義X27218，P0027。2在174例病例組中G、A等位基因頻率分別為7414％、2586％，在227例對(duì)照組中G、A等位基因頻率分別為7489％、2511％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞005。174例病例組中，103例普通HFMD組G、A等位基因頻率分別為7913％和2087，71例腦炎組G、A等位基因頻率分別為6910％和3099％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0033，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)現(xiàn)攜帶A等位基因的患兒較攜帶G等位基因的患兒腦炎的患病風(fēng)險(xiǎn)增加1702倍1702，95％CI10432776。3記錄174例EV71手足口病患兒的一般情況（包括性別、年齡）、主要臨床表現(xiàn)（包括最高體溫、抽搐、意識(shí)障礙、病理征）及輔助檢查（包括血WBC、CRP、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸激酶同工酶及顱腦MR），并對(duì)其基因型和等位基因分布頻率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在年齡、意識(shí)障礙及病理征方面CXCL10201AG位點(diǎn)基因型GG、GA、AA和等位基因A分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目中，AA基因型患兒的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及血糖指標(biāo)明顯高于GG和GA基因型患兒P＜005，而在其他指標(biāo)中的分布頻率未見(jiàn)明顯差異P＞005。4對(duì)腦炎組患兒腦脊液檢查結(jié)果顯示（指標(biāo)包括腦脊液葡萄糖、氯化物、蛋白質(zhì)、腦脊液細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及單核細(xì)胞比例），并對(duì)其中基因型及等位基因分布頻率進(jìn)行比較，其中，CXCL10201AG位點(diǎn)含有A等位基因的患兒其腦脊液氯化物含量及腦脊液細(xì)胞數(shù)比不含A等位基因的患兒的高，但差異不明顯P0086及P006，在葡萄糖、蛋白質(zhì)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及單核細(xì)胞比例指標(biāo)的比較中未見(jiàn)明顯差異P＞005。結(jié)論CXCL10201AG位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與EV71感染后病情嚴(yán)重程度有關(guān)，攜帶A等位基因可能不會(huì)增加EV71患病風(fēng)險(xiǎn)，但EV71引起中樞感染后可能發(fā)展為重癥，可能是EV71腦炎的遺傳易感基因CXCL10201AG位點(diǎn)基因型GG可能為避免感染EV71后發(fā)展為腦炎的保護(hù)基因型。

簡(jiǎn)介：目的監(jiān)測(cè)并分析上海地區(qū)住院和門(mén)診腹瀉兒童四種腹瀉病毒的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，以全面了解及客觀評(píng)估腹瀉病毒在兒童腹瀉發(fā)病中的作用，為腹瀉的防治和相關(guān)疫苗的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供基本數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。方法收集2006年1月至2011年12月在復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院住院的腹瀉兒童（年齡≤5歲）糞便標(biāo)本674份，并收集2010年7月至2011年12月在復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院門(mén)診就診的腹瀉兒童（年齡≤5歲）糞便標(biāo)本436份。采用RTPCR方法檢測(cè)糞便標(biāo)本中的輪狀病毒（ROTAVIRUS，RV）、杯狀病毒HUMANCALICIVIRUS，HUCV、星狀病毒HUMANASTROVIRUS，HASTV及腺病毒ADENOVIRUS，ADV。采用引物分型的方法確定RV的基因型別，采用基因測(cè)序和進(jìn)化樹(shù)分析的方法確定諾如病毒NOVIRUS，NV、札幌病毒（SAPOVIRUS，SAV）、HASTV和ADV的基因型別。采用SPSS160統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)研究結(jié)果和臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果一、20062011年住院腹瀉兒童腹瀉病毒的分子流行病學(xué)研究結(jié)果如下1腹瀉病毒的總檢出情況四種腹瀉病毒的總檢出率為921％621674，RV、HUCV、HASTV及ADV的總檢出率分別為892％601674、306％206674、301％203674及47％32674。腹瀉兒童單一病毒感染的總檢出率為435％293674，并以RV的單獨(dú)感染為主，其他三種病毒單獨(dú)感染的總檢出率均＜2％。腹瀉兒童多重病毒感染的總檢出率為486％328674，20062011年病毒混合感染的檢出率呈下降趨勢(shì)，2011年降為117％。多重混合感染中，以RVHASTV、RVHUCV及RVHUCVHASTV混合感染的檢出為主。2院內(nèi)和非院內(nèi)感染腹瀉兒童腹瀉病毒的檢出院內(nèi)感染引起腹瀉者占508％302626，以2009年606％和2008年605％最多，2011年降至245％。非院內(nèi)感染腹瀉者單一病毒的總檢出率478％，147308顯著高于院內(nèi)感染腹瀉者381％，121318（P＜005），單一病毒的感染均以RV為主。院內(nèi)感染腹瀉者感染多重腹瀉病毒的總檢出率569％，181318顯著高于非院內(nèi)感染者429％，132308P＜005，且均以RVHASTV及RVHUCV的混合感染為主。3RV基因型①G基因型雖20062011年G基因型以G3型為主，但G3型的流行呈波動(dòng)性下降趨勢(shì)，由2006年的646％降為2011年的128％，而G9和G1型的流行呈上升趨勢(shì)，且G9型511％成為2011年最主要的流行型別，G1型191％為當(dāng)年的次要流行型別。20062011年G混合基因型所占比例為103％62601，混合的G基因型種類(lèi)較多，以G1、G3及G9型的兩兩混合為主。②P基因型20062011年P(guān)基因型以P4、P8及P混合型的流行為主，而每年P(guān)基因型的流行又處于波動(dòng)性變化中。P混合型以P4P8型為主，其次為P8P10型。③組合型別P8G3型275％是上海地區(qū)20062011年間最主要的RV流行株，其次為PMG3及P4G3型。2011年P(guān)GG9型躍升為當(dāng)年最主要的流行型別405％。院內(nèi)感染和非院內(nèi)感染腹瀉兒童中檢出的RV基因型相似。4HUCV基因型檢出的206例HUCV陽(yáng)性標(biāo)本均屬NV屬且均為GⅡ型。以GⅡ4型757％，156206為主，其次為GⅡ12型223％，46206。GⅡ4型中以2006B亞型733％，151206的流行為主，同時(shí)還分別檢出2例GⅡ7型及GⅡB型。院內(nèi)感染和非院內(nèi)感染腹瀉兒童中檢出的HUCV基因型無(wú)明顯差異。5HASTV基因型住院腹瀉兒童感染HASTV的基因型別單一，均為HASTV1型。6ADV基因型ADV陽(yáng)性標(biāo)本的基因型別以AD41型為主，占500％1632，其次為AD3型250％，832。每年各種基因型的流行又有不同。院內(nèi)感染和非院內(nèi)感染腹瀉兒童檢出的ADV基因型無(wú)異。二、20102011年門(mén)診腹瀉兒童的分子流行病學(xué)研究結(jié)果如下1總檢出情況四種病毒的總檢出率為667％291436。RV檢出率最高，為433％189436，其次為HUCV294％，128436，ADV71％，31436及HASTV18％，8436。門(mén)診腹瀉兒童以單一病毒的感染為主518％，226436，而RV感染的比例最高300％，131436，其次為HUCV160％，72436。腹瀉病毒混合感染的比例為149％65436，混合感染中均為兩種病毒的混合感染，以RVHUCV的雙重感染為主。2RV的流行特點(diǎn)①流行季節(jié)和年齡分布20102011年門(mén)診RV性腹瀉以911月份為高峰，10月檢出率最高700％，0～11月齡者497％所占比例最高，963％的患兒年齡在0～3歲之間。②基因型G基因型以G1、G3和G9型的流行為主，檢出率分別為312％、286％和270％。P基因型以P8型為主910％，172189，其次為P4型53％，10189。G混合基因型以G1G9型600％，1220為主。P混合基因型檢出較少26％，主要是P8P4型。P8G3、P8G1和P8G9型是主要流行的三種組合型別，所占比例分別為275％52189、269％51189和254％48189。3HUCV的流行特點(diǎn)①流行季節(jié)和年齡分布910月為門(mén)診腹瀉兒童HUCV性腹瀉的流行高峰，9月份667％的檢出率最高，6月的檢出率也高達(dá)600％，0～11月齡者最多567％，72128，976％的腹瀉患兒在0～3歲之間。②HUCV基因型檢出的128例HUCV陽(yáng)性標(biāo)本中，126例屬NV屬，2例為SAV屬。所有NV株均為GⅡ型，并以GⅡ4型718％，92126為主，其次為GⅡB型156％，20126，尚檢出少量GⅡ12、GⅡ7及GⅡ2型。GⅡ4型中以2006B亞型656％為主，同時(shí)檢出8例2006A亞型。檢出的2例SAV分別是GⅠ2型及GⅡ1型。4HASTV基因型門(mén)診腹瀉兒童HASTV陽(yáng)性者型別均為HASTV1型。5ADV基因型以AD41型為主452％，1431，其次為AD3型226％，731及AD40型161％，531。此外還檢出2例AD12型及各1例AD2、5及19型。結(jié)論上海地區(qū)無(wú)論是住院還是門(mén)診引起兒童腹瀉的主要病毒均為輪狀病毒和諾如病毒。相比以往上海地區(qū)的監(jiān)測(cè)資料，輪狀病毒和諾如病毒的流行型別又出現(xiàn)了新的變化。院內(nèi)感染與非院內(nèi)感染腹瀉患兒的臨床癥狀、多重感染比例均存在差異，但各病毒流行的主要基因型別相似。門(mén)診腹瀉兒童腺病毒的檢出率高于住院腹瀉兒童。住院與門(mén)診腹瀉兒童杯狀病毒、腺病毒的流行型別存在一定的差異。