甜菜M14品系特異表達基因M14-341在模式植物中的表達研究.pdf

1、甜菜M14品系為郭德棟等人通過栽培甜菜(Beta vulgaris L．)和野生種白花甜菜(Beta corolliflora Zoss．)種間雜交及回交，獲得的帶有白花甜菜染色體的單體附加系(VV+IC，2n=19)，附加染色體的傳遞率高達96.5％。甜菜M14品系是以二倍體孢子無融合生殖為主要繁殖方式，有性生殖為次要繁殖方式的兼性無融合生殖體。這種具有無融合生殖特性的甜菜M14品系的獲得，為我們提供了一種良好的尋找無融合生殖相關基因

2、的材料。 本實驗室前期采用抑制消減雜交技術(suppression subtractive hybridization，SSH)和mRNA差異顯示技術(differential-display reverse transcription-PCR．DDRT-PCR)獲得了298個甜菜M14品系特異表達的ESTs(expression sequencetags，ESTs)，并挑選其中有研究價值的EST作為獲得全長的侯選EST，通過

3、快速擴增cDNA末端法(rapid amplification of cDNA ends，RACE)獲得了甜菜M14品系特異表達的M14-341基因的cDNA全長。經(jīng)生物信息學分析，M14-341基因編碼的蛋白包括MADS-box結(jié)構(gòu)域和K-結(jié)構(gòu)域，并與菠菜(spinacia oleracea)開花轉(zhuǎn)錄因子有88％的相似性，可以判定M14-341基因?qū)儆贛ADS-box基因。 為進一步研究M14-341基因的功能以及M14-3

4、41基因與無融合生殖現(xiàn)象的關系，本實驗首先利用DNAMAN軟件將M14-341蛋白與擬南芥(Arabidopsis thaliana)中部分MIKC族蛋白及其它物種的MADS-box蛋白進行了同源比對，結(jié)果表明，M14-341蛋白與擬南芥中AG蛋白同源性達74％，可以將其歸為AG基因(MADS-box基因家族“ABCDE”模型中的C類基因)的同源基因，其功能為控制花器官的發(fā)育。隨后，構(gòu)建了帶有M14-341基因cDNA全長的植物表達載體

5、pBI-M14-341，分別利用農(nóng)桿菌介導的葉盤法和花頭浸泡法將M14-341基因轉(zhuǎn)入模式植物煙草和擬南芥中，以分析轉(zhuǎn)基因植株的表型變化進而推測M14-341基因的功能。經(jīng)過PCR檢測、RT-PCR、Southern印跡、Northern印跡及GUS染色等分子生物學檢測后，共獲得24株轉(zhuǎn)基因煙草和12株轉(zhuǎn)基因擬南芥，進一步研究表明，M14-341基因在轉(zhuǎn)基因植株花器官中表達量較高，在葉和莖中表達量微弱。 對轉(zhuǎn)基因植株的表型觀測

6、發(fā)現(xiàn)：M14-341基因在轉(zhuǎn)基因植株中的組成型表達主要影響了煙草的花期及花器官的發(fā)育，轉(zhuǎn)基因煙草出現(xiàn)花期延遲，花瓣顏色變淺，數(shù)量變少，花萼與花瓣轉(zhuǎn)變?yōu)樾廴?、雌蕊類似結(jié)構(gòu)，雄蕊、雌蕊變長，果實與種子的少育或不育等現(xiàn)象：轉(zhuǎn)M14-341基因的擬南芥出現(xiàn)結(jié)實率降低，死亡率增高等變化。 對轉(zhuǎn)M14-341基岡煙草花器官與作為對照的未轉(zhuǎn)基因的野生型煙草花器官的總蛋白進行雙向電泳，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)M14-341基因煙草植株與野生型煙草對照植株