植物生物反應器的優(yōu)化研究.pdf

1、rl217346分類號UDC密級：o“編號：0313301076咿幽撼勞博士學位論文植物生物反應器的優(yōu)化研究學位申請人：一導師姓2廈職稱生化與分子生物掌；o。七rF十=月=11摘要TBSV)的p19蛋白已被報道可以有效抑制PTGS而增強GFP蛋白在植物中的瞬時表達。在農(nóng)桿菌注射煙草葉片的實驗中，p19蛋白可以使SARSCoVN蛋自的表達量在每克鮮重葉片中達到79峙，比沒有p19蛋白的對照提高了4倍。用含有SARSCoVN蛋白的植物提取液

2、對小鼠進行腹腔注射免疫，在小鼠血清中能檢測到N蛋白特異的抗體，同時小鼠脾中的細胞因子的表達水平產(chǎn)生了變化，說明了植物表達的SARS—CoVN蛋白在小鼠中引起了特異的體液免疫和細胞免疫。許多重要的藥用蛋白必須經(jīng)過前體剪切和糖基化等翻譯后修飾才能成為有活性的蛋白，而且藥用蛋白可能會因為N糖基化修飾的變化而喪失生物活性。植物與哺乳動物的N一糖基化系統(tǒng)基本相同，但也存在一些差異，其中植物糖蛋白特異的B1’2一木糖和弘l，3巖藻糖糖基具有免疫原性

3、，可能會在動物體中引起過敏反應。我們設計了RNAi載體轉化植物來沉默這兩個糖基對應的糖基轉移酶基因。我們從煙草BY2細胞(NicotianatobacumLCVBrightYellow2)中擴增出未曾報道的煙草Bl2木糖轉移酶的基因片斷和弘l，3巖藻糖轉移酶的基因片段，這兩個片斷與其它植物物種的糖基轉移酶基因的相應區(qū)域具有很高的同源性。利用這兩個片斷分別構建含有內(nèi)含子的自身互補的發(fā)夾RNA，并克隆到誘導性型載體和組成型載體中。煙草B_l

4、，2木糖轉移酶基因的RNAi片斷在穩(wěn)定轉化的煙草BY2細胞中誘導轉錄后不能使aq2木糖糖基的含量明顯下降；但是煙草洳1，3巖藻糖轉移酶基因的RNAi片斷在穩(wěn)定轉化的煙草BY2細胞中誘導轉錄后可以能al。3巖藻糖糖基的含量明顯下降。&1≯木糖轉移酶基因和ml，3巖藻糖轉移酶基因的RNAi片斷在煙草(Nicotianatobacum)中瞬時轉錄后可以降低注射的煙草葉片中Bl二木糖和al3巖藻糖的含量。植物表達的外源蛋白的分離和純化也是植物生

5、物反應器的難題之一。利用融合蛋白的方式在植物中表達目的蛋白不但可簡化外源蛋白的檢測，而且可以大大降低下游純化和分離的成本。但是為了避免融合短肽對目的蛋白結構和功能的影響，通常會在純化的同時或者之后去除融合短肽。特異性蛋白酶可以識別由幾個特定氨基酸組成的位點而進行切割，是去除融合短肽的有效工具。煙草花葉病毒(tobaccoetchvirus，TEV)NIa蛋白酶由于對識別位點的高嚴謹性和高酶切活性而得到廣泛的應用。我們發(fā)現(xiàn)李痘病毒(Plu