人溶菌酶乳腺生物反應(yīng)器的初步研究.pdf

1、人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)能水解細(xì)菌細(xì)胞壁粘多糖的β-1，4糖苷鍵，所以對(duì)革蘭陽性細(xì)菌具有直接的溶解作用，在分泌型免疫球蛋白A和補(bǔ)體的參與下對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌具有間接的溶解作用，此外它還具有消炎、消腫、組織修復(fù)、改善組織局部血液循環(huán)和分解膿液等藥理作用。因此在醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)等領(lǐng)域得到十分廣泛的應(yīng)用。 為了防治奶牛乳房炎，提高奶牛的抗病能力，試圖通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法提高人溶菌酶在奶牛乳腺細(xì)胞中表達(dá)，以降低乳房

2、炎的發(fā)病率。本研究在克隆出牛β-乳球蛋白基因5’調(diào)控序列的基礎(chǔ)上，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已克隆出人溶菌酶cDNA序列，構(gòu)建人溶菌酶基因的乳腺特異表達(dá)載體pBEL，并通過電穿孔的方法研究其在體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)情況。通過G418篩選陽性細(xì)胞，為本實(shí)驗(yàn)室利用核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供細(xì)胞來源。研究結(jié)果如下： 1.利用PCR方法擴(kuò)增了牛β-乳球蛋白基因5'調(diào)控成分，其中包括部分上游序列，第一外顯子及第一內(nèi)含子(933bp)。PCR產(chǎn)物

3、回收純化后，克隆在pMDl8-T Vector的T位點(diǎn)。序列分析結(jié)果表明：該序列與牛β-乳球蛋白突變體B前體基因、牛β-乳球蛋白基因突變體B、牛β-乳球蛋白基因的同源性分別為99％、99％、98％。軟件分析表明：該序列包括一些表達(dá)所需的調(diào)控成分，可用于構(gòu)建乳腺表達(dá)載體。 2.利用雙酶切定向克隆的方法，將真核表達(dá)載體pEGFP-Cl構(gòu)建成含有抗性基因、報(bào)告基因、人溶菌酶基因eDNA的真核表達(dá)載體pEGFP-hLYZ。用PCR和雙酶

4、切方法檢測，表明插入的人溶菌酶基因位點(diǎn)正確無誤，沒有發(fā)生影響表達(dá)的突變。 3.利用雙酶切定向克隆的方法，將擴(kuò)增的牛β-乳球蛋白基因的5'調(diào)控序列序列取代真核表達(dá)載體pEGFP-hLYZ的部分CMV作為啟動(dòng)子，構(gòu)建人溶菌酶乳腺特異性表達(dá)載體pBEL，載體有抗性基因，綠色熒光蛋白報(bào)告基因。并且保證報(bào)告基因和目的基因?yàn)榉侨诤闲捅磉_(dá)。 4.采用電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化牛乳腺上皮細(xì)胞，經(jīng)過G418的初步篩選后，通過熒光顯微鏡觀察到了綠色熒