第一部分蛋白酶活化受體2(PAR2)活化YAP的分子機(jī)制及生物學(xué)功能研究第二部分MicroRNA-181b在炎性結(jié)腸癌發(fā)展過程中的表達(dá)變化.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述：
　　第一部分 蛋白酶活化受體-2(PAR2)活化YAP的分子機(jī)制及生物學(xué)功能研究
　　腸道慢性炎癥（例如炎性腸?。┦且粋€(gè)反復(fù)損傷修復(fù)的過程，是結(jié)腸癌發(fā)生的高危因素之一，炎癌轉(zhuǎn)化是一個(gè)多分子通路參與的復(fù)雜過程。蛋白酶活化受體-2是一種介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛分布于體內(nèi)多種組織。IBD的動物模型中PAR2的表達(dá)顯著升高，但PAR2是否參與炎癥引起的組織損傷修復(fù)及再生還是未知。YAP作為Hi

2、ppo通路的重要下游分子，主要參與組織的更新和穩(wěn)態(tài)的維持。本部分主要研究PAR2活化YAP的分子機(jī)制及在DSS誘導(dǎo)腸道組織損傷修復(fù)作用。
　　首先，我們在不同細(xì)胞株中證實(shí)活化PAR2促進(jìn)YAP的入核及共轉(zhuǎn)錄活性;敲降PAR2不僅降低YAP蛋白的穩(wěn)定性，而且抑制了TEAD介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性和靶基因的轉(zhuǎn)錄。Western Blot顯示激活PAR2促進(jìn)YAP Ser127，Ser397位點(diǎn)的去磷酸化，但是這一過程并不依賴經(jīng)典的Hippo通路

3、。最近的研究提示，蛋白磷酸酶通過去磷酸化作用參與調(diào)節(jié)YAP的磷酸化狀態(tài)。我們研究發(fā)現(xiàn):利用化學(xué)抑制劑(Okadaic acid)及siRNA選擇性地抑制蛋白磷酸酶1(PP1)的活性或者干擾其表達(dá)可以阻斷PAR2引起的YAP去磷酸化，同時(shí)CoIP實(shí)驗(yàn)顯示:PP1與YAP相互結(jié)合，而且PAR2增強(qiáng)兩者的相互結(jié)合。除此之外，PAR2活化還促進(jìn)YAP Y357酪氨酸磷酸化，且SRC家族抑制劑(Dasatinib)阻斷PAR2介導(dǎo)的Y357磷酸化

4、升高。為了確定可能參與此機(jī)制的酪氨酸激酶，我們選取受PAR2調(diào)控的酪氨酸激酶FYN為目標(biāo)。敲降FYN顯著減少YAP蛋白表達(dá)量，但并不抑制PAR2引起的YAP Y357的磷酸化升高。所以，在我們檢測的結(jié)腸癌細(xì)胞中，F(xiàn)YN可能通過未知的分子機(jī)制調(diào)控YAP的穩(wěn)定性。另外，接頭蛋白GAB2也參與了PAR2對YAP的調(diào)控，siGAB2不僅可以阻止PAR2介導(dǎo)的YAP Ser127去磷酸化，且可以降低PP1及FYN的穩(wěn)定性。為了驗(yàn)證PAR2介導(dǎo)YA

5、P活化的具體生物學(xué)功能，基于YAP在組織更新中的重要性，我們建立DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在DSS損傷后修復(fù)階段（DSS后2或4天），PAR2敲降顯著抑制了小鼠結(jié)腸隱窩的數(shù)目，以及YAP蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞核的定位。這提示:PAR2參與小鼠結(jié)腸炎損傷后修復(fù)再生過程，而且這一過程可能依賴于YAP的活化。
　　綜上所述，PAR2通過調(diào)節(jié)YAP多位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)，促進(jìn)YAP的核定位、蛋白的穩(wěn)定性以及轉(zhuǎn)錄活性。在體內(nèi)，PAR2相關(guān)的Y

6、AP活化可能參與炎癥損傷引起的組織修復(fù)和再生過程。
　　第二部分 MicroRNA-181b在炎性結(jié)腸癌發(fā)展過程中的表達(dá)變化
　　miRNAs是一類重要的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，主要通過特異性靶向體內(nèi)的原癌基因或抑癌基因表達(dá)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本部分主要探討了結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型中miRNA-181b的表達(dá)變化及其可能的下游靶基因。
　　miRNA-181b的表達(dá)在結(jié)腸癌中顯著升高，但miRNA-181b是否參與炎癥

7、相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生未見報(bào)道。聯(lián)合使用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸鈉(DSS)制備結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌小鼠模型，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測不同時(shí)期小鼠結(jié)腸組織miR-181b表達(dá)。miR-181b表達(dá)在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌形成過程中逐漸升高，但單獨(dú)使用AOM或DSS均不會改變miR-181b水平。利用全基因組表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)結(jié)合不同的miRNA靶基因預(yù)測軟件初步篩選出miR-181b的下游靶基因Ipmk、E2f5、K