中間球海膽與光棘球海膽的雜交及分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、本文以中間球海膽(Strongylocentrotus intermedius)、光棘球海膽(s.nudus)及其雜交的F<,1>代為材料，通過分子標(biāo)記、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜及基因表達(dá)差異等分子遺傳學(xué)技術(shù)對兩種海膽雜交產(chǎn)生的包括雜交優(yōu)勢在內(nèi)的遺傳變異進(jìn)行了相關(guān)的研究，為海膽雜交育種提供了遺傳學(xué)依據(jù)。 主要內(nèi)容包括： 1雜交海膽的分子鑒定及生物學(xué)性狀特征。 1．1從24對SSR引物中篩選出一對，能對父母本和雜交種的基因

2、組DNA進(jìn)行有效擴(kuò)增，并且擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定。利用雜交海膽中同時擁有父母本的互補(bǔ)帶型，對雜交海膽進(jìn)行了分子鑒定。 1.2雜交海膽的外部形態(tài)特征介于雙親之間，正反交的F．代殼色、棘色等形態(tài)特征接近，都有兩種表型(一種殼為紫褐色，棘發(fā)白、尖部略紫；另一種殼和棘均為紫色)，并且兩種表型所占比例不同，殼徑在lcm左右時正交F<,1>代(中間球海膽♂×光棘球海膽♂)中為74.O％和26.0％，反交F．代(光棘球海膽♀×中間球海膽♂)中各占6

3、8.1％和31.9％；殼徑3cm左右時正交F<,1>代為77.2％和22.8％，反交F<,1>代各占70.5％和29.5[％]。交F,,1>代的生殖腺重、殼徑、體重等平均值都比母本具有不同程度的優(yōu)勢，有的時間達(dá)到顯著水平。有近10％的雜種生殖腺顏色不如母本鮮艷。 2雜交海膽(中間球海膽♀×光棘球海膽♂)群體多樣性的AFLP分析及AFLP標(biāo)記與數(shù)量性狀的相關(guān)性分析。 2．1對光棘球海膽(NU)、中間球海膽(IN)及其雜交的

4、F<,1>代(中間球海膽♀×光棘球海膽♂)(HYb，HYc兩種表型)3個群體進(jìn)行了AFLP分析，并根據(jù)遺傳距離進(jìn)行了個體聚類分析。結(jié)果表明：3個群體的多態(tài)位點(diǎn)比例分別是：81.99％，80.51％和95.95％。香農(nóng)多樣性指數(shù)分別為：0.2331±0.1273，0.2005±0.1385和0.2625±0.1067。遺傳相似度分別為：O.6876±0.0523，0.6501±0.0548和0．6552±0.0553。分子方差分析(AMO

5、VA)分析結(jié)果表明，變異來源有25.39[％]來自群體間，有74.6l％來自群體內(nèi)。盡管雜交海膽在表型上可以明顯分成兩種類型，但是通過AFLP統(tǒng)計的遺傳距離進(jìn)行的個體聚類卻聚在一起，不能分成兩個群體。 2.2對雜交海膽的生殖腺、殼徑、體重、棘長等數(shù)量性狀與AFLP標(biāo)汜進(jìn)行的相關(guān)性分析結(jié)果表明：在4對引物產(chǎn)生的標(biāo)記中，18個標(biāo)記與生殖腺重量相關(guān)顯著，3個相關(guān)極顯著，最高貢獻(xiàn)率為17.16％；21個標(biāo)記與殼徑相關(guān)顯著，5個相關(guān)極顯著

6、，最高貢獻(xiàn)率達(dá)到19.82％；17個標(biāo)記與體重相關(guān)顯著，6個相關(guān)極顯著，最高貢獻(xiàn)率達(dá)到18.31％；9個標(biāo)記與棘長相關(guān)顯著。其中有多個標(biāo)記與同一性狀相關(guān)，標(biāo)記中的多數(shù)也同時與幾個性狀相關(guān)。 3初步構(gòu)建了光棘球海膽與中間球海膽的遺傳連鎖圖譜。利用42對引物組合及1對單對雜交的父母本個體和F．代的60個個體通過“雙假測交”策略，構(gòu)建了光棘球海膽(♀)和中間球海膽(♂)的遺傳連鎖圖譜。光棘球海膽包括24個連鎖群，194個AFLP標(biāo)記，

7、標(biāo)記間平均間隔17.1cM，覆蓋基因組總長度2988．3cM；中間球海膽包括23個連鎖群，199個AFLP標(biāo)記，平均問隔15.4cM，總長度2614．8cM。 4光棘球海膽的主要卵黃蛋白MYP(major yolk protein)cDNA全序列的克隆和分析及MYP基因在中間球海膽和雜交F1，代(中間球海膽♀×光棘球海膽♂)生殖腺不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異。 4．1光棘球海膽的MYP cDNA全長4047 bp，編碼13

8、49個氨基酸。序列比對結(jié)果表明，MYP的3個區(qū)域(133—474；490—658；941一1089)表現(xiàn)出與脊椎動物鐵傳遞蛋白的保守結(jié)構(gòu)域同源。MYP中的半胱氨酸在20個位置與鐵傳遞蛋白相一致。說明MYP是鐵輸送蛋白，這與其它動物的卵黃蛋白是不同的。同時通過MYP cDNA序列分析了8種海膽的進(jìn)化關(guān)系，光棘球海膽與紅海膽的遺傳距離最近，為0.069±0.01，與同科的馬糞海膽、紫球海膽、中間球海膽的遺傳距離分別是0.095±0.012、

9、0.098±0.011和0.10l±0.012。與白棘三列海膽、擬球海膽及綠海膽的遺傳距離分別為0.216±0.017、0.218±0.018和0.535±0.028。 4．2 Real time RT—F'CR結(jié)果表明：MYP基因在海膽雌雄個體生殖腺中轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)差異不明顯。MYP基因在中間球海膽生殖腺發(fā)育的4個時期的表達(dá)呈快速的下降趨勢，而在雜交海膽呈緩慢下降的趨勢。在生殖腺的4個發(fā)育期中，中間球海膽的雌雄個體的MYP基