莧菜甜菜紅素合成的生理生化與分子生物學(xué)研究.pdf

1、甜菜紅素是一種吲哚來源的天然植物色素，具有抗氧化、抗癌等生理功能，廣泛存在于不含花青素的部分石竹目部分植物中。莧菜富含甜菜紅素，有取代甜菜作為甜菜紅素主要來源的趨勢(shì)。盡管參與甜菜紅素合成途徑中一些關(guān)鍵基因和多數(shù)關(guān)鍵酶已經(jīng)在甜菜等作物中被發(fā)現(xiàn)，但甜菜色素合成機(jī)制仍未被完全揭示，而且莧菜中參與甜菜紅素合成的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶也大多未見報(bào)道。因此，研究莧菜甜菜紅素合成機(jī)制可以進(jìn)一步完善甜菜紅素代謝通路，也為更好利用莧菜資源提供理論依據(jù)。

2、　　本文以葉用莧菜為材料，進(jìn)行了甜菜紅素合成途徑關(guān)鍵基因的克隆，克隆到3條糖基轉(zhuǎn)移酶基因、1條AmaTyDC基因和1條AmaDODA基因的cDNA序列和gDNA序列，并克隆了AmaB5-GT和AmaDOPA5-GT基因的啟動(dòng)子序列。研究了這些基因在莧菜不同品種間、不同組織部位及在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和不同光質(zhì)處理后的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析了這些基因的表達(dá)與莧菜中甜菜紅素含量的關(guān)系。以紅莧品種‘大紅’莧菜為材料，對(duì)葉片的紅色部分和綠色部分進(jìn)行轉(zhuǎn)

3、錄組測(cè)序，揭示影響甜菜紅素合成的相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)及可能的影響因素，結(jié)合紅色葉片和綠色葉片的生理生化指標(biāo)系統(tǒng)地分析了莧菜葉片紅綠部分呈色的分子機(jī)理。
　　1、莧菜甜菜紅素合成相關(guān)基因及啟動(dòng)子克隆與分析
　　利用 RT-PCR和 RACE技術(shù)成功從‘大紅’莧菜中克隆了3條糖基轉(zhuǎn)移酶基因：AmaDOPA5-GT（GenBank登錄號(hào)為：kp174811，長(zhǎng)度為1,700 bp）、AmaB6-GT（GenBank登錄號(hào)為：kp17481

4、2，長(zhǎng)度為1,674 bp）、AmaB5-GT（GenBank登錄號(hào)為：kp174810，長(zhǎng)度為1,666 bp），1條多巴脫羧酶基因AmaTyDC（GenBank登錄號(hào)為：Kp165397，長(zhǎng)度為1,669 bp）和1條雙加氧酶基因AmaDODA（GenBank登錄號(hào)為：kp165399，長(zhǎng)度為1,085 bp） cDNA序列。并獲得了這5條基因的gDNA序列，其中只有AmaDODA具有2個(gè)內(nèi)含子，其它4條不具有內(nèi)含子。
　　并

5、進(jìn)一步對(duì) AmaDOPA5-GT和 AmaB5-GT基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行了克隆，通過對(duì)其順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，它們均含有豐富的響應(yīng)光、激素、厭氧、干旱及其它脅迫順式作用元件以及 MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)這兩個(gè)基因的表達(dá)可能受光、激素、逆境脅迫以及MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。
　　2、莧菜甜菜色素含量與合成相關(guān)基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)分析
　　2.1、不同莧菜品種、不同組織部位中甜菜紅素含量和合成相關(guān)基因的表達(dá)情況研究
　　不同

6、莧菜品種中甜菜紅素含量差異較大，全紅莧菜甜菜紅素含量最高，綠莧中含量較少。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，AmaB6-GT、AmaB5-GT、AmaDOPA5-GT和AmaTyDC四條基因均在紅莧菜中表達(dá)量最高，AmaTyDC和AmaB6-GT在各莧菜品種中的表達(dá)量與它們含有的甜菜紅素趨勢(shì)一致，推測(cè)它們直接參與甜菜紅素合成的調(diào)控；AmaDODA基因在四個(gè)莧菜品種中的表達(dá)量差異不大，這可能與其參與其它代謝有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)AmaB5-GT、AmaB6

7、-GT、AmaDOPA5-GT在‘大紅’莧菜各組織器官中的表達(dá)分析，結(jié)果表明它們分別在葉柄、葉、根和綠葉部分表達(dá)量最高，這與甜菜紅素含量：紅色葉片>綠色葉片>紅莖>根>綠莖和葉柄含量的差異趨勢(shì)不一致。
　　2.2、不同激素處理對(duì)莧菜甜菜紅素累積與相關(guān)基因表達(dá)量的影響
　　細(xì)胞分裂素（KT和6-BA）處理可提高莧菜幼苗中甜菜紅素含量。其中KT通過誘導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)而提高莧菜幼苗中甜菜紅素的含量；而6-BA促進(jìn) AmaDO

8、DA和AmaB5-GT的表達(dá)，6-BA通過提高多巴雙加氧酶的活性，增加了 AmaDOPA5-GT和AmaB5-GT可以催化生成莧菜苷的底物，從而促進(jìn)了莧菜中甜菜紅素的累積。而外源GA3和2,4-D抑制色素的累積。2,4-D處理的幼苗中，AmaB5-GT、AmaTyDC和AmaB6-GT的表達(dá)量與色素含量一致的降低。GA3具有轉(zhuǎn)移甜菜紅素合成前體物的作用，所以其它相關(guān)合成的基因表達(dá)水平高并不能使莧菜中累積較多的甜菜紅素。
　　2.3

9、、不同光質(zhì)處理對(duì)莧菜甜菜紅素累積與相關(guān)基因表達(dá)量的影響
　　對(duì)不同光質(zhì)處理?xiàng)l件下莧菜幼苗中甜菜紅素含量的變化的研究表明短波長(zhǎng)光質(zhì)（藍(lán)光）有利于色素的累積，這與莧菜幼苗中AmaTyDC、AmaB5-GT和AmaDOPA5-GT三個(gè)基因的表達(dá)量一致，說明這3個(gè)基因表達(dá)對(duì)甜菜紅素的合成影響較大。然而這3個(gè)基因與AmaDODA在紅光照射下表達(dá)量也較高，可能與莧菜幼苗中莧菜苷含量減少引起的反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　3、甜菜紅素分布及甜菜紅素

10、含量不同的莧菜品種、組織部位生理生化指標(biāo)差異研究
　　3.1、甜菜紅素分布和淀粉含量研究
　　徒手切片法對(duì)甜菜紅素在‘大紅’莧菜和‘白圓葉’莧菜不同組織部位的分布情況的研究表明：甜菜紅素在‘大紅’莧菜中主要分布在葉片背面靠近葉脈的表皮細(xì)胞及各組織部位的維管束周圍的鞘細(xì)胞中，在‘白圓葉’莧菜的各組織部位觀察不到甜菜紅素的存在。另外，在‘白圓葉’莧菜的葉片中淀粉粒數(shù)量明顯多于‘大紅’莧菜，同時(shí)在‘大紅’莧菜中僅在靠近葉脈部位發(fā)現(xiàn)

11、較多的淀粉粒。
　　3.2、紅葉和綠葉部分光合速率、抗氧化能力、葉綠素?zé)晒獠町愌芯?br>　　分別測(cè)定了‘大紅’莧菜紅葉部分和綠葉部分的光合速率。發(fā)現(xiàn)‘大紅’莧菜葉片紅色部分凈光合速率明顯低于綠色部分。
　　研究了‘大紅’莧菜紅葉和綠葉部分抗氧化能力差異，發(fā)現(xiàn)‘大紅’莧菜紅色部分比綠色部分具有更高的SOD酶活性和總抗氧化能力。說明了甜菜紅素具有清除植物體內(nèi)羥自由基和活性氧的能力。
　　研究了室溫條件（25℃）和高溫處理

12、（40℃）下，‘大紅’莧菜紅葉和綠葉部分葉綠素?zé)晒獠町惽闆r，發(fā)現(xiàn)在室溫條件（25℃）下，綠葉部分光合能力明顯高于紅葉部分，而在高溫（40℃）處理后，莧菜葉片紅色部分光合能力的降低水平明顯低于綠葉部分，說明甜菜紅素對(duì)莧菜具抗熱脅迫作用。
　　4、莧菜葉片紅色部分和綠色部分轉(zhuǎn)錄組差異分析
　　利用RNA-Seq技術(shù)比較分析了‘大紅’莧菜葉片紅色部分和綠色部分轉(zhuǎn)錄組差異，獲得80,026條莧菜Unigene，其中2,178條uni

13、gene（1,320條上調(diào)，858條下調(diào)）在紅綠葉樣品間表達(dá)差異顯著。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能歸類分析發(fā)現(xiàn)：這些基因主要涉及次級(jí)代謝、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、光合作用、淀粉和糖代謝等途徑。這些基因的差異表達(dá)在一定程度上驗(yàn)證了我們?cè)谇捌讷@得的結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)類黃酮代謝相關(guān)基因在紅色葉片中下調(diào)顯著，這印證了甜菜紅素合成和類黃酮在植物中的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，也可以在一定程度上解釋甜菜紅素和花青素“不共存”現(xiàn)象。另外，一些MYB轉(zhuǎn)錄因子家族基因在紅綠葉部分