多基因標(biāo)記輔助選擇及Lbx基因家族的分子生物學(xué)研究.pdf

1、隨著分子數(shù)量遺傳學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的發(fā)展,有關(guān)動(dòng)物遺傳標(biāo)記輔助選擇方面的研究也在不斷深入。在過(guò)去的研究中,已發(fā)現(xiàn)黑素皮質(zhì)素受體-4(Melanocortin-4Receptor,MC4R),心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(Heart FABP,H-FABP),瘦素(Leptin,LEP),氟烷基因(Halothane,HAL),鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)和肌細(xì)胞生成素(myogenin,MyoG)等基因與胴體、肉質(zhì)性狀相關(guān)。

2、我們通過(guò)PCR-RFLP分析了以上基因在DIV2系(中國(guó)瘦肉豬新品系)和7個(gè)純種豬中的多態(tài)性分布,并在DIV2系中進(jìn)行了遺傳效益分析,同時(shí)研究了多基因標(biāo)記同時(shí)選擇的可能性。在脊椎動(dòng)物中,Lbx基因(Ladybird-like genes)家族對(duì)于肌肉形成和神經(jīng)發(fā)育起著重要作用。本研究對(duì)豬Lbx1和Lbx2基因進(jìn)行了分離和遺傳效應(yīng)分析。作為重要的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象之一,DNA甲基化對(duì)基因的表達(dá)發(fā)揮重要的調(diào)控功能。因此,我們?cè)诩∪饨M織中研究了L

3、bx1和Lbx2基因表達(dá)和甲基化之間的關(guān)系。并通過(guò)誘導(dǎo)分化C2C12細(xì)胞,研究DNA甲基化對(duì)MyoD(myogenic differentiation1),Myf5(myogenic factor5),Pax7(paired box7)和Lbx1基因表達(dá)的影響。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.通過(guò)PCR-RFLP分析了MC4R,H-FABP,LEP,HAL,CAST和MyoG基因多態(tài)位點(diǎn)在DIV2系和7個(gè)純種豬中的分布,并在DIV

4、2系中進(jìn)行了遺傳效應(yīng)分析,結(jié)果表明:(1)MC4R基因中的TaqⅠ酶切位點(diǎn)與平均背膘厚、瘦肉率顯著相關(guān)(P<0.05)；(2)LEP基因中的HinfⅠ酶切位點(diǎn),BB基因個(gè)體的日增重極顯著高于AA基因型個(gè)體(P<0.01),AB基因個(gè)體的日增重顯著高于AA基因型個(gè)體(P<0.05)；(3)H-FABP基因第二內(nèi)含子的HaeⅢ酶切位點(diǎn),DD基因型個(gè)體的瘦肉率顯著高于dd基因型個(gè)體(P<0.05)；(4)在CAST基因.MspⅠ位點(diǎn)中,EE基

5、因型個(gè)體的日增重顯著高于FF基因型個(gè)體(P<0.05),EF基因型個(gè)體的日增重極顯著高于FF基因型個(gè)體(P<0.01)。
　　 2.連鎖不平衡分析顯示:在DIV2系、大白豬、長(zhǎng)白豬和八眉豬中,MC4R和LEP基因位點(diǎn)問(wèn)、LEP和H-FABP基因位點(diǎn)間的連鎖不平衡度不顯著(P>0.05)；在DIV2系、大白豬、長(zhǎng)白豬、皮特蘭豬和八眉豬中,MC4R與H-FABP基因位點(diǎn)間的連鎖不平衡度不顯著(P>0.05)。這表明兩個(gè)位點(diǎn)間是獨(dú)立的

6、,因此對(duì)其中一個(gè)位點(diǎn)的選擇不會(huì)影響另一個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率。
　　 3.采用電子克隆方法獲得了兩個(gè)候選基因的編碼區(qū)序列:(1)Lbx1,mRNA中的CDS全長(zhǎng)846bp,編碼281個(gè)氨基酸:(2)Lbx2,mRNA.中的CDS全長(zhǎng)591bp,編碼196個(gè)氨基酸。通過(guò)比較不同物種氨基酸序列,對(duì)以上兩個(gè)基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)豬Lbx1與牛、小鼠、人、犬、類人猿進(jìn)化關(guān)系較近,豬Lbx2與牛、猩猩、犬進(jìn)化關(guān)系較近。
　　

7、 4.RT-PCR分析顯示:豬Lbx1基因在肌肉組織中高表達(dá)；Lbx2基因在肝、腎和脾中微弱表達(dá),但在肌肉組織中不表達(dá)。在出生后肌肉發(fā)育過(guò)程中,Lbx1基因的表達(dá)處于動(dòng)態(tài)變化中,一月齡之內(nèi),表達(dá)量相對(duì)較高,在二月齡時(shí),表達(dá)量顯著下調(diào),該變化趨勢(shì)與產(chǎn)后肌肉組織中肌衛(wèi)星細(xì)胞分化比例的變化一致,由于Lbx1基因已被證實(shí)在肌衛(wèi)星細(xì)胞分化初期表達(dá),因此我們推測(cè)該基因可能與出生后肌肉增生機(jī)制有關(guān)。在不同肌肉組織中的分析表明:豬Lbx1基因在股二頭肌

8、中的表達(dá)量顯著高于在咬肌,背最長(zhǎng)肌和半腱肌中的表達(dá)量,推測(cè)Lbx1基因的表達(dá)量與肌纖維類型并無(wú)直接關(guān)系。
　　 5.通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù),在豬背最長(zhǎng)肌中分析Lbx1和Lbx2基因啟動(dòng)子和外顯子1的甲基化狀態(tài)。發(fā)現(xiàn):(1)Lbx1基因的甲基化差異區(qū)在外顯子1處的CpG島內(nèi)；(2)Lbx2基因的甲基化差異區(qū)在CpG島外的啟動(dòng)子區(qū)。Lbx1基因CpG島內(nèi)的高密度甲基化可能參與下調(diào)該基因在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量。
　　 6.通過(guò)對(duì)豬

9、Lbx1基因組SNP掃描,發(fā)現(xiàn)2個(gè)引起酶切位點(diǎn)改變的SNP:g.752A>G和g-1559C>G。在大白×梅山F2代資源家系中進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),Lbx1基因g.752A>G突變與眼肌面積和內(nèi)脂率顯著相關(guān)(P<0.05),該突變位于內(nèi)含子,并不影響蛋白結(jié)構(gòu),因此該相關(guān)可能是由于g.752A>G突變與真正的功能突變處于連鎖不平衡狀態(tài)造成的。
　　 7.RT-PCR分析顯示:MyoD和Myf5基因在未分化及分化的C2C12細(xì)胞中均