富含α2巨球蛋白血清的分子生物學研究及其在創(chuàng)傷性關節(jié)炎早期干預治療中的作用.pdf

1、研究背景：
　　前交叉韌帶（Anterior cruciate ligament,ACL）損傷是青壯年尤其是競技體育運動者中最常見的膝關節(jié)韌帶損傷之一。臨床上以ACL重建術為其治療的主要方法。但ACL重建術并不能降低ACL損傷所繼發(fā)的創(chuàng)傷性關節(jié)炎(Post-traumatic osteoarthritis，PTOA)發(fā)生的風險和進程。最新的研究表明，在關節(jié)創(chuàng)傷后一周內關節(jié)腔即出現(xiàn)大量的炎癥因子及氧自由基等，促使大量的軟骨細胞凋亡，

2、成為啟動PTOA關節(jié)軟骨退變和損傷的始動因素。因此及早抑制這些炎性因子的活性對阻止或者減緩PTOA的發(fā)展至為關鍵。α-2巨球蛋白(Alpha-2-macroglobulin，A2M)作為一種廣譜的蛋白酶抑制劑在關節(jié)軟骨損傷時被合成和分泌到關節(jié)液中，可有效地抑制IL-1誘導軟骨基質降解的基質金屬蛋白酶（MMP-3、9、13）和多種炎癥因子（IL-1β、6、8, TNF-a和GM-CSF）的活性，但其在關節(jié)軟骨損傷后血清和關節(jié)液中分泌情況卻

3、一直未見相關研究。本課題組在前期研究中也已經證實采用前交叉韌帶切斷術（Anterior cruciate ligament transection，ACLT）制作的SD大鼠的創(chuàng)傷性關節(jié)炎(PTOA)模型中，適量的補充外源性的A2M可以明顯的減緩關節(jié)軟骨的退變進程，具有非常顯著的正性關節(jié)軟骨保護作用。但所使用的A2M為大分子量蛋白質，免疫原性強，異種A2M長期關節(jié)腔注射極有可能引起免疫反應，因此尋求一種更加簡單的提純或富含A2M血清的方法

4、并觀察其對創(chuàng)傷性關節(jié)炎（PTOA）的治療效果具有非常重要臨床價值。
　　研究目的：
　　1）分析A2M在ACL損傷時血清、關節(jié)液中的分布變化，明確與關節(jié)軟骨退化存在的關聯(lián),為外源性補充A2M提供理論依據(jù)；
　　2）采用超濾離心法制備富含 A2M血清（A2M-Rich Serum，A2MRS），檢測A2MRS中的A2M的蛋白濃度及蛋白活性，并分析其分子生物學特性；
　　3）觀察富含A2M血清（A2M-Rich Se

5、rum，A2MRS）對創(chuàng)傷性關節(jié)炎（PTOA）的關節(jié)軟骨是否具有明顯的治療效果或減緩關節(jié)軟骨退化的作用。
　　研究方法：
　　1）首先以2月齡96只SD大鼠為實驗對象，分為兩組，每組48只。實驗組通過前交叉韌帶切斷術（Anterior cruciate ligament transection，ACLT）建立PTOA動物模型，對照組采取假手術切開，不行ACLT。術后3天及1、2、4、8及12周每個時間點各組處死8只大鼠，收集

6、血清及膝關節(jié)盥洗液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測大鼠ACL損傷后不同時間點的關節(jié)盥洗液、血清中A2M的濃度變化規(guī)律，同時采用番紅O固綠染色觀察PTOA隨著時間的延長其關節(jié)軟骨退化的病理進程與體液中A2M的含量變化是否存在某種關聯(lián)，探討A2M是否可以作為關節(jié)軟骨退變早期診斷及監(jiān)測病理進程的生物標記物,為外源性補充A2M提供理論依據(jù)。
　　2）采用超濾離心法制備富含A2M血清（A2M-Rich Serum, A2MRS），采

7、用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、蛋白免疫印跡法（Western Blot）等方法檢測其分子生物學性質。
　　3）選取80只健康成年SD大鼠,分為4組，每組20只:Sham+Saline（空白對照組）、ACLT+HA2MRS（高劑量組）、ACLT+LA2MRS（低劑量組）、ACLT+Saline（陽性對照組）。手術后3天、2周、4周依據(jù)分組的不同關節(jié)腔定時注射30ul生理鹽水或30ul不同濃度A2MRS(高劑量組A2M為20ug/

8、ul,低劑量組A2M為10ug/ul)。每個時間點治療后24小時關節(jié)腔注射MMP680免疫熒光探針，采用熒光分子斷層成像系統(tǒng)（Fluorescence Molecular Tomography，F(xiàn)MT）動態(tài)檢測基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP）在關節(jié)液中濃度的變化，觀察A2MRS對基質金屬蛋白酶是否具有抑制作用。術后8周統(tǒng)一處死動物，小動物X線片觀察膝關節(jié)退變的影像學表現(xiàn)，印度墨水染色評估關節(jié)軟骨

9、大體損傷情況，并行Mankin’s評分；脛骨平臺關節(jié)軟骨采用甲苯胺藍、番紅O固綠染色、蘇木精-伊紅染色（HE染色）和免疫組化法觀察A2MRS對PTOA軟骨病理退變是否具有減緩或者修復作用，采用OARIS評分系統(tǒng)評估關節(jié)軟骨的病理變化并作統(tǒng)計學分析；股骨髁關節(jié)軟骨采用實時熒光定量PCR法（RT-PCR）對軟骨組織中II型膠原(COL-II)、X型膠原（COL-X）、基質金屬蛋白酶3、13（Matrix metalloproteinase，

10、MMP-3、13）、軟骨聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Runt蛋白相關轉錄因子-2（Runt-related transcription factor, Runx2)等指標進行檢測，評估富含A2M血清對關節(jié)軟骨損傷在基因層面上的調控作用。采用ELISA檢測關節(jié)液中基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP-13）濃度。
　　結果：
　　1)ACLT術后實驗組與對照組的關節(jié)軟骨早期大體觀察與組

11、織病理學觀察并無明顯的區(qū)別，但術后8周開始，實驗組的關節(jié)軟骨退化明顯加重。實驗組術后3天、1周、8周關節(jié)盥洗液中A2M的濃度較血清中的濃度明顯增高。并且實驗組術后3天關節(jié)液盥洗液中的A2M的濃度與對照組關節(jié)盥洗液中A2M濃度相比較明顯增高，術后1周開始迅速降低與對照組無差別。
　　2)采用超濾離心法制備的富含A2M血清（A2M-Rich Serum,A2MRS）經ELISA檢測結果為：人的血清中A2M的濃度為2.43±0.66mg

12、/ml,富含A2M血清（A2MRS）中A2M的濃度為19.52±4.37mg/ml, A2MRS中的A2M的濃度較正常血清中的濃度提高了8.04倍。蛋白免疫印跡（Western Blot）結果顯示：富含A2M血清（A2MRS）相比正常血清在180kD處有非常明顯的蛋白濃聚現(xiàn)象。A2M蛋白活性檢測表明：富含A2M血清（A2MRS）的A2M蛋白活性較正常血清A2M的活性提高2.13倍。
　　3)動物體內實驗觀察A2MRS對PTOA關節(jié)

13、軟骨退化的治療作用，通過熒光分子斷層成像系統(tǒng)（Fluorescence Molecular Tomography，F(xiàn)MT）檢測結果表明：富含A2M血清（A2MRS）早期可以明顯抑制創(chuàng)傷性關節(jié)炎關節(jié)液中基質金屬蛋白酶3、13（Matrix metalloproteinase，MMP-3、13）。
　　膝關節(jié)的X光片的影像學表現(xiàn)：ACLT+Saline組的髕骨下緣有明顯的骨贅增生，其余三組在影像學表現(xiàn)上均沒有觀察到明顯的退行性改變。<

14、br>　　印度墨水染色表明：Sham+Saline組中軟骨表面未見明顯損傷，ACLT+Saline組軟骨表面損傷最為嚴重，而ACLT+A2MRS組關節(jié)面損傷明顯減輕，其中ACLT+HA2MRS組中軟骨損傷在ACL切斷組中最小，改良Mankin's評分顯示：ACLT+HA2MRS組和ACLT+LA2MRS與ACLT+Saline組相比較均有明顯統(tǒng)計學意義，但ACLT+HA2MRS組與ACLT+LA2MRS組相比較無統(tǒng)計學意義。
　　

15、脛骨平臺番紅O固綠染色、HE染色及甲苯胺藍染色結果均顯示：ACLT+Saline組軟骨厚度明顯變薄，軟骨表面有較多小的裂隙，軟骨細胞分布紊亂，糖胺多糖染色較差。ACLT+LA2MRS組軟骨細胞聚集成團，軟骨厚度降低，ACLT+HA2MRS組中軟骨表面較為平滑，細胞排列較整齊，Sham+Saline組軟骨表面完整，結構良好，細胞分布均勻，糖胺多糖染色良好。
　　OARIS評分顯示：ACLT+Saline組為10.15±2.88，AC

16、LT+HA2MRS組為5.54±2.61,ACLT+LA2MRS組為4.87±2.74，Sham+Saline為3.05±1.39，統(tǒng)計學分析表明：兩個實驗組（ACLT+HA2MRS和ACLT+LA2MRS）與陽性對照組（ACLT+Saline）均有顯著性差異（p<0.0001）,兩個實驗組（ACLT+HA2MRS和ACLT+LA2MRS）與空白對照組（Sham+Saline）均有顯著性差異。而ACLT+HA2MRS組與ACLT+LA2

17、MRS組之間經統(tǒng)計學分析不具有顯著性差異（p=0.22）。
　　在II型膠原的免疫組化染色上，ACLT+HA2MRS組和ACLT+LA2MRS組的陽性細胞明顯比ACLT+Saline組染色強，即ACLT+HA2MRS組較ACLT+LA2MRS組陽性細胞要強，但兩組II型膠原的免疫組化染色均低于Sham+Saline組。
　　在X型膠原和MMP-13的免疫組化染色上，ACLT+Saline組陽性細胞在四組中表達最強，Sham+

18、Saline組的陽性細胞表達最弱，而兩個治療組 ACLT+HA2MRS組及ACLT+LA2MRS組在X型膠原表達上介于ACLT+Saline組與Sham+Saline組之間，并且同樣存在劑量依賴性，即ACLT+HA2MRS的X型膠原的表達比ACLT+LA2MRS組弱。
　　RT-PCR結果表明A2MRS具有較為明顯的抑制負性基因X型膠原（COL-X）、基質金屬蛋白酶3、13（Matrix metalloproteinase3、13

19、，MMP-3、13）、Runt蛋白相關轉錄因子-2（Runt-related transcription factor, Runxn2)的mRNA表達。
　　關節(jié)液中MMP-13的ELISA測定結果表明：ACLT+HA2MRS組、ACLT+LA2MRS組與Sham+Saline組中關節(jié)液中MMP-13濃度均顯著低于ACLT+Saline,統(tǒng)計學分析有顯著性差異，但前三組之間組相比均無統(tǒng)計學差異。
　　結論：
　　1.關