miRNA在萎縮性骨不連中的調(diào)控作用及其分子生物學(xué)機制.pdf

1、目的
　　miRNA(microribonucleicacid，微小核糖核酸)是一種單鏈非編碼小分子RNA（ribonucleicacid，核糖核酸），在基因表達調(diào)控方面具有廣泛和普遍的作用，但目前對其在骨折愈合與不愈合中的調(diào)控作用尚知之甚少。本研究擬首先篩選萎縮性骨不連修復(fù)組織中異常表達的miRNA種類，并通過生物信息學(xué)方法預(yù)測表達上調(diào)miRNA的成骨功能相關(guān)靶基因，再從細胞水平驗證萎縮性骨不連組織中表達上調(diào)miRNA對預(yù)測靶基

2、因的調(diào)控作用，從而闡明miRNA在萎縮性骨不連發(fā)病過程中的調(diào)控作用及其分子生物學(xué)機制，為骨不連的基礎(chǔ)和臨床研究提供理論和實踐依據(jù)。
　　方法
　?。?）以臨床患者萎縮性骨不連修復(fù)組織（A組，3例）與正常骨折愈合后內(nèi)固定鋼板取出時鋼板周圍骨痂組織（B組，3例）為研究對象，采用ExiqonmiRCURY?LNAmicroRNA芯片(11.0版)對各組織中提取的RNA進行miRNA篩選分析。在篩選出萎縮性骨不連組織中異常表達的mi

3、RNA后，采用熒光qRT-PCR（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)）對芯片結(jié)果中A組表達上調(diào)的miRNA在兩種組織的表達水平進行驗證，并采用瀏覽計算機預(yù)測數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)方法預(yù)測其可能的靶基因，探尋miRNA可能參與的骨折愈合和萎縮性骨不連相關(guān)病理生理過程。
　?。?）上調(diào)miRNA與預(yù)測靶基因關(guān)系的驗證：取人骨髓全血，離心分離hBMSCs（human

4、bonemesenchymalstemcells，人骨髓基質(zhì)干細胞），傳代培養(yǎng)。將人工合成的四種表達上調(diào)miRNA的雙鏈小RNA轉(zhuǎn)染入第四代hBMSCs，48小時后提取細胞總RNA，采用qRT-PCR、WB（WesternBlotting，蛋白印跡）、雙熒光素酶報告基因檢測等多種方法，驗證miRNA對預(yù)測靶基因的作用，確認miRNA在萎縮性骨不連中的具體調(diào)控作用和分子生物學(xué)機制。
　?。?）miRNA和相應(yīng)靶基因在誘導(dǎo)hBMSCs

5、成骨分化過程中表達水平及功能的相關(guān)研究：采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)hBMSCs成骨分化的方法，觀察在誘導(dǎo)hBMSCs成骨分化過程中不同時間點（0,12h,1d,2d,4d,7d,14d）相應(yīng)miRNA、靶基因mRNA（messengerribonucleicacid，信使核糖核酸）與蛋白表達水平的變化趨勢，進一步驗證這些上調(diào)miRNA在誘導(dǎo)成骨分化中的調(diào)控作用,并探討成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液的誘導(dǎo)成分在此過程中促進成骨分化的作用。
　　結(jié)果

6、r>　?。?）萎縮性骨不連修復(fù)組織相對鋼板周圍骨痂組織有9種miRNA發(fā)生1.5倍以上表達上調(diào)（hsa-miR-149*，hsa-miR-221，hsa-miR-628-3p，hsa-miR-654-5p，以及5種hsa-miRPlus），9種miRNA發(fā)生1.5倍以上表達下調(diào)（hsa-let-7b*，hsa-miR-220b，hsa-miR-513a-3p，hsa-miR-551a，hsa-miR-576-5p，hsa-miR-123

7、6，kshv-miR-K12-6-5p，以及2種hsa-miRPlus）。qRT-PCR結(jié)果提示，數(shù)據(jù)庫中收錄并在A組表達上調(diào)的四種miRNA在組織水平的表達變化趨勢與芯片結(jié)果一致。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，四種表達上調(diào)miRNA的預(yù)測靶基因包括多種成骨功能相關(guān)基因。
　　（2）分離培養(yǎng)的hBMSCs具有典型的干細胞形態(tài)特征，貼壁時間短，細胞融合快，體外擴增容易，可以向成骨細胞誘導(dǎo)，適合作為種子細胞用于后續(xù)的實驗研究。在成功將上調(diào)miR

8、NA的合成雙鏈小RNA轉(zhuǎn)染進第四代hBMSCs48h后，提取細胞總RNA，qRT-PCR檢測表明，三種預(yù)測靶基因（hsa-miR-149*的預(yù)測靶基因ALPL、hsa-miR-221的預(yù)測靶基因PDGFA和hsa-miR-654-5p的預(yù)測靶基因BMP2）的mRNA表達量受到明顯抑制，其余預(yù)測靶基因的mRNA無明顯下降；WB則表明上述三種預(yù)測靶基因的蛋白表達量均受到明顯抑制。雙熒光素酶報告基因檢測則證明三種預(yù)測靶基因的預(yù)測靶位點分別直接

9、受到hsa-miR-149*、hsa-miR-221和hsa-miR-654-5p的靶向調(diào)控，其中ALPL的兩個預(yù)測靶位點只有第二個受到hsa-miR-149*的直接調(diào)控。
　　（3）誘導(dǎo)hBMSCs成骨分化過程中，得到確認的成骨性靶基因ALPL、PDGFA和BMP2的mRNA和蛋白表達量在多數(shù)時間點有明顯增加，尤其以誘導(dǎo)分化后2～7天變化最為顯著（ALPL蛋白為1～7天），第14天時又有所下降。不同時間點的miRNA、靶基因mR

10、NA和蛋白水平存在表達差異，其中hsa-miR-149*和hsa-miR-654-5p的變化趨勢與各自靶基因ALPL和BMP2的mRNA及蛋白表達水平總體上呈負相關(guān)，而hsa-miR-221與PDGFA的變化趨勢無明顯負相關(guān)關(guān)系，兩者的關(guān)系有待進一步研究。
　　結(jié)論
　?。?）萎縮性骨不連修復(fù)組織中存在miRNA的異常表達；四種在該組織中上調(diào)的miRNA(hsa-miR-149*、hsa-miR-221、hsa-miR-62

11、8-3p和hsa-miR-654-5p)有可能通過抑制多種成骨功能相關(guān)靶基因的表達，在調(diào)控骨折向萎縮性骨不連發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　（2）細胞水平驗證表明：四種在組織水平上調(diào)的miRNA中，hsa-miR-149*與其預(yù)測的靶基因ALPL、hsa-miR-221與其預(yù)測的靶基因PDGFA、hsa-miR-654-5p與其預(yù)測的靶基因BMP2之間存在直接調(diào)控作用，異常上調(diào)的miRNA通過抑制成骨功能相關(guān)靶基因ALPL、PDGF

12、A和BMP2的表達而限制其生物學(xué)功能，引起了萎縮性骨不連的發(fā)生發(fā)展。
　?。?）多種成骨功能相關(guān)靶基因的mRNA和蛋白表達水平在誘導(dǎo)hBMSCs成骨分化過程中大多數(shù)時間點發(fā)生了表達上調(diào)，hsa-miR-149*和hsa-miR-654-5p與其相應(yīng)靶基因ALPL和BMP2的mRNA及蛋白表達變化趨勢呈負相關(guān)，說明這兩種miRNA在誘導(dǎo)成骨分化過程中與其靶基因mRNA和蛋白表達水平的調(diào)控密切相關(guān)。
　　簡述之，本研究從萎縮性骨