致病性地霉的分子生物學(xué)鑒定.pdf

1、目的:臨床上致病性地霉有林生地霉和白地霉等,林生地霉(Geotrichum silvicola)為新近發(fā)現(xiàn)的一種罕見地霉,首次從巴西果蠅和印度柞蠶幼蟲身上分離出來(lái)[1]。2002年,我科從一例膿癬患兒的皮損中分離得到一株林生地霉,首次證實(shí)該菌可以感染人類[2]。2005年,我科又自一例中毒性表皮壞死松解癥患者的血液中分離出一株林生地霉[3],2006年黃文明[4]等從足部潰瘍中再次分離處一株林生地霉,說(shuō)明本菌既能引起皮膚地霉病,也可導(dǎo)致

2、系統(tǒng)性感染。白地霉(Geotrichum candidum)是地霉屬的經(jīng)典代表菌種,白地霉引起的感染可侵犯呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、耳、關(guān)節(jié)及皮膚。但以支氣管感染最多見,偶可致全身播散性感染。2007年Sfakianakis等[5]報(bào)道了1例由白地霉所致皮膚地霉病,同年我國(guó)鐘華等[6]報(bào)告了1例先天性免疫缺陷病合并播散性馬爾尼非青霉、白念珠菌及白地霉感染的病例,2008年李秀麗[7]等首次報(bào)道了白地霉引起陰道炎兩例。有關(guān)林生地霉的形

3、態(tài)學(xué)、致病性、動(dòng)物試驗(yàn)、營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)等各方面均已作了研究[8-9][2-4]。而白地霉目前研究大多集中在其菌體蛋白的開發(fā)利用上,對(duì)其臨床致病性研究相對(duì)較少,鑒定仍依賴于表型特征。因此我們將從分子生物學(xué)鑒定方面對(duì)致病性地霉菌做進(jìn)一步研究。
　　 近年來(lái),隨著科技的發(fā)展,分子生物學(xué)技術(shù)已被廣泛的運(yùn)用于真菌的實(shí)驗(yàn)室診斷,而且被證明是真菌分類的有效方法[10]。任意引物聚合酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)是1990年分別在不同的實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)展起來(lái)

4、的,已在真菌分類鑒定和分型研究方面顯示出巨大潛力,Liu等[11]用AP-PCR法進(jìn)行真菌鑒定。本研究采用任意引物聚合酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)對(duì)林生地霉皮損株、血液株和白地霉進(jìn)行分子生物學(xué)方面的鑒定,從而對(duì)不同菌種間的親緣關(guān)系作相似性分析,同一菌種不同部位的菌株做多態(tài)性分析,為臨床提供種間及種內(nèi)鑒定的簡(jiǎn)單、快速、可靠的方法。為探討病原微生物的傳染源、傳播途徑以及流行病學(xué)調(diào)查等提供依據(jù)。從而有利于臨床早期診斷和指導(dǎo)用藥。
　　 方

5、法:林生地霉皮損株與血液株為河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院真菌室保存,均由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定。白地霉標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。均經(jīng)過(guò)復(fù)蘇培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)和生化鑒定。用E.Z.N.A.Yeast DNA Kit提取地霉菌基因組DNA,采用任意引物AP3、ATG、RP2、OPA-10、S034、S040、S101、S167、S368對(duì)臨床上致病性白地霉、林生地霉皮損株和血液株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)各病原菌的DNA指紋的特

6、征進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:成功提取了地霉菌的基因組DNA,其純度和濃度均能滿足PCR反應(yīng)的要求。地霉的種間鑒定結(jié)果顯示,用九種不同引物擴(kuò)增,不同菌種間可以擴(kuò)增出大小、數(shù)目不一的DNA條帶,尤其是使用引物S040、S167、S368、AP3、OPA-10和RP2擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA帶型種間差異較明顯。不同種真菌的DNA經(jīng)擴(kuò)增后顯示不同的DNA帶型,且同一模板在多次實(shí)驗(yàn)中均產(chǎn)生一致的DNA帶型,而且不同次提取的同種不同株真菌的DNA經(jīng)擴(kuò)

7、增后顯示的主要DNA帶型也是相同的。分離自不同感染部位的林生地霉用隨機(jī)引物S0034、S040和S368擴(kuò)增后主要DNA帶型有明顯差異。而S167、AP3、ATG和RP2擴(kuò)增的條帶多態(tài)性均不明顯,DNA帶型基本一致。
　　 結(jié)論:(1)采用E.Z.N.A.Yeast DNA Kit提取的地霉菌基因組DNA可以用于PCR反應(yīng)。(2)以AP3、ATG、RP2、OPA-10、S034、S040、S101、S167、S368為引物,用A

8、P-PCR可對(duì)臨床致病性地霉從基因分子水平上進(jìn)行鑒定。AP-PCR可作為鑒定致病性地霉簡(jiǎn)單、快速、可靠的方法。(3)任意引物S040、S167、S368、AP3、OPA-10、RP2擴(kuò)增的條帶多態(tài)性都比較明顯,能把白地霉和林生地霉較好的區(qū)別開來(lái)。(4)對(duì)于林生地霉種內(nèi)鑒定(皮損株和血液株),任意引物S034、S040和S368擴(kuò)增的條帶多態(tài)性比較明顯,DNA帶型有明顯不一致,而引物S167、AP3、ATG和RP2擴(kuò)增的DNA帶型基本一致