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文檔簡介
1、目的:將攜帶人白細胞介素-10(human interleukin-10,hIL-10)基因的真核表達質(zhì)粒經(jīng)尾靜脈高壓注射的方法導(dǎo)入大鼠體內(nèi),探討hIL-10基因治療對去卵巢大鼠骨代謝及種植體骨結(jié)合的影響,為hIL-10基因治療骨代謝性疾病及促進種植體骨結(jié)合奠定基礎(chǔ)。
方法:1.擴增、鑒定攜帶hIL-10基因的質(zhì)粒EX-A0007-M03,利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)入293T及RAW264.7細胞;熒光顯微鏡及ELISA檢測目的基因
2、的表達,破骨細胞形成及骨吸收實驗鑒定hIL-10蛋白的生物學(xué)功能。2.以hIL-10為報告基因,通過尾靜脈高壓注射的方法將hIL-10質(zhì)粒導(dǎo)入大鼠體內(nèi),觀察不同注射條件對hIL-10在體內(nèi)表達的影響,通過冰凍切片、ELISA及免疫組化等方法驗證目的基因的表達。3.切除3月齡雌性SD大鼠雙側(cè)卵巢建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型,通過體重監(jiān)測、子宮病理、血清ALP、Ca、P濃度、雙能X線、骨組織病理及生物力學(xué)檢測等方法驗證絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型建立成
3、功。4.在大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型建立成功的基礎(chǔ)上,每周經(jīng)尾靜脈高壓注射導(dǎo)入hIL-10質(zhì)粒,于2w、4w、8w處死動物,通過體重監(jiān)測、血清ALP、Ca、P、TRAP、IL-1β濃度、雙能X線、骨組織病理及生物力學(xué)檢測等方法觀察hIL-10基因治療對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨代謝的影響。5.大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型建立成功后在其脛骨植入純鈦種植體,每周經(jīng)尾靜脈高壓注射導(dǎo)入hIL-10質(zhì)粒,于2w、4w、8w處死動物,通過X線、顯微CT、制作帶種植
4、體硬組織磨片等方法觀察hIL-10基因治療對骨質(zhì)疏松癥大鼠種植體骨結(jié)合的影響。
結(jié)果:1.凝膠電泳和DNA測序鑒定證實EX-A0007-M03上攜帶的外源基因為hIL-10;EX-A0007-M03脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染293T及RAW264.7細胞獲得成功,部分細胞發(fā)出綠色熒光,ELISA檢測表明目的基因獲得表達,轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的hIL-10蛋白在體外具有抑制破骨細胞形成和骨吸收的生物學(xué)功能。2.冰凍切片、ELISA和免疫組化檢測
5、表明經(jīng)尾靜脈高壓注射后hIL-10在大鼠體內(nèi)得到高效的表達。3.去卵巢后12w大鼠體重較SHAM組明顯增加,子宮萎縮,骨量丟失明顯,血清ALP濃度升高,骨力學(xué)性能減退,呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松狀態(tài)。4.hIL-10基因治療可抑制OVX所致的TNF-α和TRAP5b的升高(P<0.05),但對骨質(zhì)疏松癥大鼠和正常大鼠的骨代謝無明顯影響。5.hIL-10基因治療對骨質(zhì)疏松癥大鼠和正常大鼠的骨結(jié)合無顯著性差異(P>0.05)。
結(jié)論
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