miR-106b-5p靶向調(diào)控SETD2基因?qū)δI透明細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究.pdf

1、以腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）為代表的腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于其對(duì)放化療及生物免疫治療缺乏敏感，故成為腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等晚期病人預(yù)后差的關(guān)鍵因素。深入研究腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理，并探尋合適的標(biāo)靶是當(dāng)前該病診斷、治療及預(yù)后的潛在方向。在腎透明細(xì)胞癌中，SETD2基因是僅次于 VHL和PBRM1的第三大抑癌基因，而有關(guān)它的表達(dá)缺失或下調(diào)機(jī)制，目前尚不明晰。微

2、小 RNA（miRNA）是一類(lèi)短鏈非編碼 RNA，通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因，下調(diào)靶基因表達(dá)并影響其所在的信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而在生物體生命活動(dòng)尤其是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中扮演重要角色。結(jié)合生物信息學(xué)及相關(guān)的預(yù)測(cè)軟件，我們發(fā)現(xiàn)miRNA與SETD2存在潛在的關(guān)聯(lián)性，即SETD2基因的表達(dá)缺失或下調(diào)可能源于某一或某些 miRNAs的負(fù)性調(diào)控。因此，本研究旨在從 miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方面著手探索 SETD2表達(dá)缺失或下調(diào)的機(jī)制，以闡明 SE

3、TD2及相關(guān)miRNAs對(duì)ccRCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為未來(lái)的臨床診治提供理論依據(jù)。我們將通過(guò)檢測(cè) SETD2基因及各預(yù)測(cè)候選 miRNAs在人 ccRCC中的表達(dá)水平，揭示它們?cè)赾cRCC臨床診斷與治療中的潛在意義；通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，探索并驗(yàn)證ccRCC中靶向調(diào)控SETD2的miRNAs；研究miRNA調(diào)控SETD2對(duì)ccRCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探索其潛在的作用機(jī)制。本研究分為以下三個(gè)部分：
　　第一部分 SETD2基因及

4、各預(yù)測(cè)miRNAs在人腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)研究
　　目的：檢測(cè)人正常腎組織與腎透明細(xì)胞癌（ccRCC）組織及細(xì)胞中SETD2基因、各預(yù)測(cè)miRNAs的表達(dá)差異，篩選與SETD2潛在關(guān)聯(lián)的miRNA(s）。
　　方法：采用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)和western blot法分別檢測(cè)40例臨床組織標(biāo)本及細(xì)胞系中 SETD2基因的 mRNA水平和蛋白表達(dá)量，并分析其表達(dá)差異。隨機(jī)選取30例配對(duì)ccRCC組織與正常腎組織，采用免疫

5、組織化學(xué)染色法(IHC)檢測(cè)并分析 SETD2蛋白在正常腎與癌組織中的表達(dá)差異。應(yīng)用 Target-Scan、microRNA.org、miRWalk等多個(gè)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件逆向篩選可能靶向作用于SETD2基因的miRNAs，同時(shí)結(jié)合在線ccRCC的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出可能調(diào)控SETD2的miRNAs。采用qPCR檢測(cè)各預(yù)測(cè)miRNAs在細(xì)胞系及組織標(biāo)本中的表達(dá)水平并比較其差異，同時(shí)分析各預(yù)測(cè) miRNAs與 SETD2表達(dá)的相關(guān)性

6、。
　　結(jié)果：相較正常腎組織，SETD2基因的 mRNA在77.50％（31/40）的 ccRCC組織中顯著下調(diào)，而 SETD2蛋白表達(dá)水平在65.00%（26/40）的 ccRCC組織中顯著下調(diào)。相較 HK-2細(xì)胞系，786-O和SN12-PM6細(xì)胞中的 SETD2基因mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。免疫組織化學(xué)染色分析結(jié)果顯示 SETD2蛋白在正常腎組織中76.67%（23/30）呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，13.33%（4/30）呈弱陽(yáng)性表

7、達(dá)，10.00%（3/30）為低表達(dá)；在 ccRCC組織中，80.00%（24/30）呈低表達(dá)或無(wú)表達(dá)，16.67%（5/30）呈弱陽(yáng)性表達(dá)，3.33%（1/30）為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p、miR-142–5p和miR-20a-5p被篩選作為可能調(diào)控 SETD2基因的候選 miRNAs。相較 HK-2細(xì)胞系，miR-23b-5p、miR-34b-3p、 miR-106b-5p和mi

8、R-142–5p在786-O和SN12-PM6細(xì)胞系中均高表達(dá)，而 miR-20a-5p表達(dá)差異不明顯。相較正常腎組織，miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p、 miR-142–5p和miR-20a-5p在 ccRCC中顯著上調(diào)的比例分別為：60.00%（24/40）、55.00%（22/40）、67.50%（27/40）、47.50%（19/40）和35.00%（14/40）。經(jīng) t檢驗(yàn)分析顯示在 ccRC

9、C組織與正常腎組織中表達(dá)有顯著差異的 miRNAs分別是：miR-23b-5p、miR-34b-3p、 miR-106b-5p和miR-142–5p。進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)在ccRCC組織中SETD2的mRNA水平與miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：在 ccRCC中，SETD2基因是一個(gè)重要的抑癌基因，其表達(dá)缺失或下調(diào)可能與候選 miRNAs：miR-23b-5p

10、、miR-34b-3p和miR-106b-5p的異常上調(diào)有關(guān)。
　　第二部分在腎透明細(xì)胞癌中miR-106b-5p靶向調(diào)控SETD2及其機(jī)制研究
　　目的：在miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平探索 SETD2基因在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)缺失或下調(diào)的機(jī)制。
　　方法：采用化學(xué)合成法獲得各預(yù)測(cè) miRNAs的抑制劑 anti-miRNAs及模擬物mimics，分別將其轉(zhuǎn)入ccRCC細(xì)胞系786-O和SN12-PM6，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定

11、量PCR及 western blot法檢測(cè) SETD2基因 mRNA和蛋白的表達(dá)變化。構(gòu)建含SETD2基因3’-UTR野生型和突變型的雙熒光素酶報(bào)告載體，采用雙熒光素酶法進(jìn)行檢測(cè)分析以探索候選miRNAs對(duì)SETD2的調(diào)控方式。設(shè)計(jì)“逆轉(zhuǎn)”實(shí)驗(yàn)，將小干擾 RNA si-SETD2與候選 miRNA的抑制劑共轉(zhuǎn)入腎癌細(xì)胞系，應(yīng)用qPCR和western blot法分別檢測(cè)SETD2基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，進(jìn)一步探索候選miRNA

12、對(duì)SETD2基因可能的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)入各預(yù)測(cè) miRNAs的抑制劑后，僅 anti-miR-106b-5p使786-O和SN12-PM6細(xì)胞系中的 SETD2基因 mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。而反過(guò)來(lái)，向786-O和SN12-PM6細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入miR-106b-5p的模擬物mimic后，SETD2基因的 mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)。雙熒光素酶檢測(cè)分析結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)入miR-106b-5p的模擬物mimic后，HK-2、7

13、86-O和SN12-PM6細(xì)胞系中SETD2基因3’-UTR野生型的熒光素酶活性明顯降低，而3’-UTR突變型無(wú)顯著影響。相反，在轉(zhuǎn)入 miR-106b-5p的抑制劑后，786-O和SN12-PM6細(xì)胞系中 SETD2基因3’-UTR野生型的熒光素酶活性顯著提高，而3’-UTR突變型無(wú)明顯改變。另外，在“逆轉(zhuǎn)”實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)入 anti-miR-106b-5p可使786-O和SN12-PM6細(xì)胞系中的SETD2基因mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)

14、，而同時(shí)轉(zhuǎn)入si-SETD2將逆轉(zhuǎn)anti-miR-106b-5p轉(zhuǎn)入所致的SETD2表達(dá)上調(diào)作用。
　　結(jié)論：SETD2基因是 miR-106b-5p的一個(gè)新的靶基因，在腎透明細(xì)胞癌中SETD2基因的表達(dá)缺失或下調(diào)可能是由于miR-106b-5p的過(guò)表達(dá)所致。
　　第三部分 miR-106b-5p調(diào)控SETD2對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究
　　目的：研究miR-106b-5p調(diào)控SETD2對(duì)腎透明細(xì)

15、胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的潛在影響，并探索其作用機(jī)制。
　　方法：同前述“逆轉(zhuǎn)”實(shí)驗(yàn)，將轉(zhuǎn)染分為5組，即 anti-NC+ si-NC、anti-miR-106b-5p+ si-NC、si-NC、si-SETD2和anti-miR-106b-5p+ si-SETD2，分別轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞系786-O與 SN12-PM6，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期和凋亡的可能變化，并采用EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖的改變。同時(shí)，我們采用qPCR與wester

16、n blot法分別檢測(cè)上述各組轉(zhuǎn)染情況下腎癌細(xì)胞中p53、caspase3的表達(dá)變化。同時(shí)提取各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的核蛋白，western blot法檢測(cè)核蛋白 H3K36me3可能的表達(dá)變化。另外，通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè) miR-106b-5p調(diào)控 si-SETD2對(duì)p53啟動(dòng)子活性可能的影響，并應(yīng)用 ChIP技術(shù)探索 p53基因啟動(dòng)子與H3K36me3的潛在關(guān)系。
　　結(jié)果：流式細(xì)胞周期、凋亡檢測(cè)及EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示在78

17、6-O與SN12-PM6中，沉默 miR-106b-5p均可使兩種腎癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，即G0/G1比例增加，而S期減少，且細(xì)胞增殖明顯減少，細(xì)胞凋亡明顯增加，而干擾 SETD2表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，即 G0/G1期減少，S期增多，且細(xì)胞增殖明顯增加，細(xì)胞凋亡明顯減少。此外，干擾 SETD2的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默 miR-106b-5p所致的細(xì)胞周期阻滯、凋亡增加和增殖抑制效應(yīng)。qPCR結(jié)果顯示在786-O與 SN12-P

18、M6細(xì)胞中，沉默 miR-106b-5p可使 p53基因mRNA明顯上調(diào)，而干擾SETD2表達(dá)一方面使p53 mRNA明顯下調(diào)，另一方面還可逆轉(zhuǎn)沉默 miR-106b-5p所致的 p53基因 mRNA上調(diào)效應(yīng)。各轉(zhuǎn)染組caspase-3基因的 mRNA變化無(wú)明顯改變。Western blot結(jié)果顯示在沉默 miR-106b-5p后，786-O與 SN12-PM6細(xì)胞中 p53蛋白、H3K36me3蛋白、活化型caspase-3蛋白（cl

19、eaved caspase-3）的表達(dá)顯著增加，而前體 caspase-3蛋白（procaspase-3）明顯下調(diào)；相較對(duì)照組，干擾 SETD2表達(dá)可使 p53蛋白、H3K36me3蛋白、活化型caspase3蛋白（cleaved caspase-3）表達(dá)下調(diào)，而前體caspase3蛋白（procaspase-3）增加；此外，干擾SETD2可逆轉(zhuǎn)沉默miR-106b-5p所致的 p53、H3K36me3、cleaved caspase-

20、3三種蛋白上調(diào)及 procaspase-3蛋白下調(diào)。ChIP實(shí)驗(yàn)與雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在786-O與SN12-PM6中，沉默miR-106b-5p可使 H3K36me3與 p53啟動(dòng)子區(qū)的相對(duì)結(jié)合量顯著增加，p53啟動(dòng)子載體的螢火蟲(chóng)/海腎熒光素酶活性也明顯增加；而干擾 SETD2表達(dá)則使H3K36me3與 p53啟動(dòng)子區(qū)的相對(duì)結(jié)合量顯著減少，p53啟動(dòng)子載體的螢火蟲(chóng)/海腎熒光素酶活性亦明顯減少；此外，干擾 SETD2也逆轉(zhuǎn)了沉默miR