miR-106b-5p靶向調控SETD2基因對腎透明細胞癌細胞生物學行為的影響及機制研究.pdf

1、以腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）為代表的腎細胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，由于其對放化療及生物免疫治療缺乏敏感，故成為腎癌術后復發(fā)、轉移等晚期病人預后差的關鍵因素。深入研究腎透明細胞癌的發(fā)病機理，并探尋合適的標靶是當前該病診斷、治療及預后的潛在方向。在腎透明細胞癌中，SETD2基因是僅次于 VHL和PBRM1的第三大抑癌基因，而有關它的表達缺失或下調機制，目前尚不明晰。微

2、小 RNA（miRNA）是一類短鏈非編碼 RNA，通過在轉錄后水平負性調控靶基因，下調靶基因表達并影響其所在的信號通路傳導，從而在生物體生命活動尤其是腫瘤發(fā)生、進展中扮演重要角色。結合生物信息學及相關的預測軟件，我們發(fā)現(xiàn)miRNA與SETD2存在潛在的關聯(lián)性，即SETD2基因的表達缺失或下調可能源于某一或某些 miRNAs的負性調控。因此，本研究旨在從 miRNA介導的轉錄后調控方面著手探索 SETD2表達缺失或下調的機制，以闡明 SE

3、TD2及相關miRNAs對ccRCC細胞生物學行為的影響，為未來的臨床診治提供理論依據(jù)。我們將通過檢測 SETD2基因及各預測候選 miRNAs在人 ccRCC中的表達水平，揭示它們在ccRCC臨床診斷與治療中的潛在意義；通過體外實驗，探索并驗證ccRCC中靶向調控SETD2的miRNAs；研究miRNA調控SETD2對ccRCC細胞生物學行為的影響，并探索其潛在的作用機制。本研究分為以下三個部分：
　　第一部分 SETD2基因及

4、各預測miRNAs在人腎透明細胞癌中的表達研究
　　目的：檢測人正常腎組織與腎透明細胞癌（ccRCC）組織及細胞中SETD2基因、各預測miRNAs的表達差異，篩選與SETD2潛在關聯(lián)的miRNA(s）。
　　方法：采用實時定量PCR(qPCR)和western blot法分別檢測40例臨床組織標本及細胞系中 SETD2基因的 mRNA水平和蛋白表達量，并分析其表達差異。隨機選取30例配對ccRCC組織與正常腎組織，采用免疫

5、組織化學染色法(IHC)檢測并分析 SETD2蛋白在正常腎與癌組織中的表達差異。應用 Target-Scan、microRNA.org、miRWalk等多個靶點預測軟件逆向篩選可能靶向作用于SETD2基因的miRNAs，同時結合在線ccRCC的miRNA表達譜數(shù)據(jù)庫，篩選出可能調控SETD2的miRNAs。采用qPCR檢測各預測miRNAs在細胞系及組織標本中的表達水平并比較其差異，同時分析各預測 miRNAs與 SETD2表達的相關性

6、。
　　結果：相較正常腎組織，SETD2基因的 mRNA在77.50％（31/40）的 ccRCC組織中顯著下調，而 SETD2蛋白表達水平在65.00%（26/40）的 ccRCC組織中顯著下調。相較 HK-2細胞系，786-O和SN12-PM6細胞中的 SETD2基因mRNA和蛋白表達均顯著下調。免疫組織化學染色分析結果顯示 SETD2蛋白在正常腎組織中76.67%（23/30）呈強陽性表達，13.33%（4/30）呈弱陽性表

7、達，10.00%（3/30）為低表達；在 ccRCC組織中，80.00%（24/30）呈低表達或無表達，16.67%（5/30）呈弱陽性表達，3.33%（1/30）為強陽性表達。miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p、miR-142–5p和miR-20a-5p被篩選作為可能調控 SETD2基因的候選 miRNAs。相較 HK-2細胞系，miR-23b-5p、miR-34b-3p、 miR-106b-5p和mi

8、R-142–5p在786-O和SN12-PM6細胞系中均高表達，而 miR-20a-5p表達差異不明顯。相較正常腎組織，miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p、 miR-142–5p和miR-20a-5p在 ccRCC中顯著上調的比例分別為：60.00%（24/40）、55.00%（22/40）、67.50%（27/40）、47.50%（19/40）和35.00%（14/40）。經(jīng) t檢驗分析顯示在 ccRC

9、C組織與正常腎組織中表達有顯著差異的 miRNAs分別是：miR-23b-5p、miR-34b-3p、 miR-106b-5p和miR-142–5p。進一步通過相關性分析發(fā)現(xiàn)在ccRCC組織中SETD2的mRNA水平與miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p表達水平呈顯著負相關。
　　結論：在 ccRCC中，SETD2基因是一個重要的抑癌基因，其表達缺失或下調可能與候選 miRNAs：miR-23b-5p

10、、miR-34b-3p和miR-106b-5p的異常上調有關。
　　第二部分在腎透明細胞癌中miR-106b-5p靶向調控SETD2及其機制研究
　　目的：在miRNA介導的轉錄后調控水平探索 SETD2基因在腎透明細胞癌中表達缺失或下調的機制。
　　方法：采用化學合成法獲得各預測 miRNAs的抑制劑 anti-miRNAs及模擬物mimics，分別將其轉入ccRCC細胞系786-O和SN12-PM6，應用實時熒光定

11、量PCR及 western blot法檢測 SETD2基因 mRNA和蛋白的表達變化。構建含SETD2基因3’-UTR野生型和突變型的雙熒光素酶報告載體，采用雙熒光素酶法進行檢測分析以探索候選miRNAs對SETD2的調控方式。設計“逆轉”實驗，將小干擾 RNA si-SETD2與候選 miRNA的抑制劑共轉入腎癌細胞系，應用qPCR和western blot法分別檢測SETD2基因mRNA和蛋白水平的表達變化，進一步探索候選miRNA

12、對SETD2基因可能的調控作用。
　　結果：轉入各預測 miRNAs的抑制劑后，僅 anti-miR-106b-5p使786-O和SN12-PM6細胞系中的 SETD2基因 mRNA和蛋白表達顯著上調。而反過來，向786-O和SN12-PM6細胞系中轉入miR-106b-5p的模擬物mimic后，SETD2基因的 mRNA和蛋白表達進一步下調。雙熒光素酶檢測分析結果顯示在轉入miR-106b-5p的模擬物mimic后，HK-2、7

13、86-O和SN12-PM6細胞系中SETD2基因3’-UTR野生型的熒光素酶活性明顯降低，而3’-UTR突變型無顯著影響。相反，在轉入 miR-106b-5p的抑制劑后，786-O和SN12-PM6細胞系中 SETD2基因3’-UTR野生型的熒光素酶活性顯著提高，而3’-UTR突變型無明顯改變。另外，在“逆轉”實驗中，轉入 anti-miR-106b-5p可使786-O和SN12-PM6細胞系中的SETD2基因mRNA和蛋白表達顯著上調

14、，而同時轉入si-SETD2將逆轉anti-miR-106b-5p轉入所致的SETD2表達上調作用。
　　結論：SETD2基因是 miR-106b-5p的一個新的靶基因，在腎透明細胞癌中SETD2基因的表達缺失或下調可能是由于miR-106b-5p的過表達所致。
　　第三部分 miR-106b-5p調控SETD2對腎透明細胞癌細胞生物學行為的影響及其機制研究
　　目的：研究miR-106b-5p調控SETD2對腎透明細

15、胞癌細胞生物學行為的潛在影響，并探索其作用機制。
　　方法：同前述“逆轉”實驗，將轉染分為5組，即 anti-NC+ si-NC、anti-miR-106b-5p+ si-NC、si-NC、si-SETD2和anti-miR-106b-5p+ si-SETD2，分別轉染腎癌細胞系786-O與 SN12-PM6，應用流式細胞術檢測各轉染組細胞周期和凋亡的可能變化，并采用EdU法檢測細胞增殖的改變。同時，我們采用qPCR與wester

16、n blot法分別檢測上述各組轉染情況下腎癌細胞中p53、caspase3的表達變化。同時提取各轉染組細胞的核蛋白，western blot法檢測核蛋白 H3K36me3可能的表達變化。另外，通過雙熒光素酶實驗檢測 miR-106b-5p調控 si-SETD2對p53啟動子活性可能的影響，并應用 ChIP技術探索 p53基因啟動子與H3K36me3的潛在關系。
　　結果：流式細胞周期、凋亡檢測及EdU細胞增殖實驗檢測結果顯示在78

17、6-O與SN12-PM6中，沉默 miR-106b-5p均可使兩種腎癌細胞的細胞周期阻滯在G0/G1期，即G0/G1比例增加，而S期減少，且細胞增殖明顯減少，細胞凋亡明顯增加，而干擾 SETD2表達則促進細胞周期的進展，即 G0/G1期減少，S期增多，且細胞增殖明顯增加，細胞凋亡明顯減少。此外，干擾 SETD2的表達可逆轉沉默 miR-106b-5p所致的細胞周期阻滯、凋亡增加和增殖抑制效應。qPCR結果顯示在786-O與 SN12-P

18、M6細胞中，沉默 miR-106b-5p可使 p53基因mRNA明顯上調，而干擾SETD2表達一方面使p53 mRNA明顯下調，另一方面還可逆轉沉默 miR-106b-5p所致的 p53基因 mRNA上調效應。各轉染組caspase-3基因的 mRNA變化無明顯改變。Western blot結果顯示在沉默 miR-106b-5p后，786-O與 SN12-PM6細胞中 p53蛋白、H3K36me3蛋白、活化型caspase-3蛋白（cl

19、eaved caspase-3）的表達顯著增加，而前體 caspase-3蛋白（procaspase-3）明顯下調；相較對照組，干擾 SETD2表達可使 p53蛋白、H3K36me3蛋白、活化型caspase3蛋白（cleaved caspase-3）表達下調，而前體caspase3蛋白（procaspase-3）增加；此外，干擾SETD2可逆轉沉默miR-106b-5p所致的 p53、H3K36me3、cleaved caspase-

20、3三種蛋白上調及 procaspase-3蛋白下調。ChIP實驗與雙熒光素酶實驗結果顯示在786-O與SN12-PM6中，沉默miR-106b-5p可使 H3K36me3與 p53啟動子區(qū)的相對結合量顯著增加，p53啟動子載體的螢火蟲/海腎熒光素酶活性也明顯增加；而干擾 SETD2表達則使H3K36me3與 p53啟動子區(qū)的相對結合量顯著減少，p53啟動子載體的螢火蟲/海腎熒光素酶活性亦明顯減少；此外，干擾 SETD2也逆轉了沉默miR