生物材料生物相容性評價方法和評價指標的實驗研究.pdf

1、[目的]通過對羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)及其納米粒子和高密度殼聚糖(HighDensityChitosan，HDC)生物相容性研究，探討生物材料生物相容性評價的方法和指標。 [材料和方法]①高溫煅燒碾磨法制備HA及溶膠凝膠法制備HA納米微粒，用掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM)、能譜儀(energydispersivespectromete

2、r,EDS)及X射線衍射(x-raydiffraction，XRD)等進行表征及特性檢測；②不同濃度和不同時間采用MTT法繪出小鼠結(jié)締組織成纖維L-929細胞的標準曲線圖；③通過形態(tài)學觀察、MTT實驗、溶血試驗、HA腹腔注射法小鼠LD50檢測等方法評價HA的生物相容性；④通過流式細胞(FlowCytometry，F(xiàn)CM)檢測HA、HDC對體外培養(yǎng)小鼠L-929生長的影響；⑤通過單細胞凝膠電泳(Singlecellgelelectroph

3、oresis，SCGE)檢測HA浸提液、HDC浸提液及nHA浸提液對培養(yǎng)的L-929細胞DNA損傷的影響；⑥通過免疫細胞化學(immunocytochemistry，IC)檢測HA對L-929細胞P53的表達的影響。 [結(jié)果]①制備的nHA的表征：掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)制備的納米粒子直徑為50nm-88nm，透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)制備的納米粒子為圓形、平均粒徑50納米；EDS證實制備的納米材料只含有H、O、Ca與P四種元素；XRD顯示制

4、備的納米材料的各X射線衍射譜圖的特異峰線高度和位置與JCPDS(粉末衍射標準聯(lián)合會)數(shù)據(jù)庫卡片中的nHA結(jié)果一致；②細胞生長標準曲線圖顯示最佳細胞濃度6000個/孔，最佳時間為72h；③MTT實驗示不同濃度HA及HDC材料浸提液具有促進細胞增殖作用與倒置顯微鏡觀察的L-929細胞呈梭形、三角形或不規(guī)則形的生長良好結(jié)果一致；溶血實驗證明HA及HDC無溶血作用，符合生物材料的安全性要求；HA小鼠LD50檢測發(fā)現(xiàn)其LD509.98g/kg，具

5、有較廣的安全值范圍，具有良好的生物相容性；④FCM檢測顯示50％、75％、100％HA浸提液及25％、50％、75％、100％HDC浸提液組能明顯增加L-929細胞的S，G2期和M期細胞比例，降低G0和G1期細胞比例，顯示其促細胞增殖作用，而25％HA浸提液組結(jié)果與陰性相似；FCM檢測表明隨浸提液濃度的升高，細胞凋亡率逐漸上升；⑤SCGE檢測結(jié)果顯示：隨HA及其納米粒子浸提液濃度的遞增，SCGE彗星率逐漸增大；并呈現(xiàn)時間依賴性；HA的相

6、對危險度與HA浸提液濃度和作用時間呈正相關性，提示HA對L-929細胞DNA可能有損傷作用；而HDC對L-929細胞無明顯的DNA損傷作用。⑥P53免疫細胞化學實驗顯示各濃度HA浸提液組P53表達陽性，提示可能HA材料對L-929細胞具有致突變作用。 [結(jié)論]①成功制備了nHA；②制備的HA及其納米粒子和HDC具有良好的細胞相容性；③FCM檢測可為生物材料的生物相容性評價提供新的方法，有望成為生物材料生物相容性評價研究的重要指標