人工肝支持系統雜交型三維立體式生物反應器的研究.pdf

1、肝功能衰竭是各種嚴重肝病的終末期表現，肝移植是肝功能衰竭治療的最有效手段，但供肝來源的緊缺限制了肝移植的廣泛使用。以培養(yǎng)肝細胞為材料的體外生物人工肝支持系統有望為肝功能衰竭患者等待肝移植或通過自身肝再生恢復提供過渡的“橋梁”。迄今為止，幾種新型的生物人工肝己進入Ⅱ～Ⅲ期臨床試驗，并取得了令人鼓舞的結果。生物人工肝的三大要素是生物反應器、肝細胞和體外裝置，其中，生物反應器是生物人工肝的核心部分，其性能直接關系到生物人工肝支持治療的效果和作

2、用。故生物反應器的設計和構建在生物人工肝研究與臨床應用中具有重要的意義。 隨著生物人工肝研究的不斷深入，圍繞著為肝細胞提供良好的生長、代謝環(huán)境和為肝功能衰竭患者血液或血漿與肝細胞相互作用、進行物質交換提供理想的場所兩大基本功能，在傳統中空纖維型生物反應器的基礎上，一些新的生物反應器不斷出現，歸納起來主要為四大類：中空纖維型、灌流式/支架型、細胞包裹/懸液型、平板式生物反應器。其中中空纖維型生物反應器具有較強的免疫阻隔和物質傳輸作

3、用，但肝細胞培養(yǎng)效果較差，灌流式/支架型生物反應器具備良好的肝細胞培養(yǎng)效果，而缺乏免疫阻隔和灌流不均。如果能夠將灌流式/支架型與中空纖維型生物反應器有效結合，可揚長避短，這種雜交型生物反應器尚未見研究報道。本實驗設計和構建雜交型生物反應器，力求實現肝細胞培養(yǎng)、物質傳輸、免疫阻隔三者的完美結合，提高生物反應器的性能和肝支持效果，為生物人工肝治療肝功能衰竭提供新的實驗依據。 本實驗選擇有代表性的6種半透膜材料進行肝細胞(L02細胞)

4、培養(yǎng)，通過檢測細胞LDH漏出量和DNALadder細胞凋亡評價膜材料的細胞毒性，觀察各種膜材料上L02細胞的貼壁率、細胞活性、DNA總量、總蛋白合成和CYP1A2活性等，篩選出肝細胞相容性最佳的半透膜材料用于中空纖維制備。 利用非對稱性冷卻成型技術制備單內皮層PES平板膜和中空纖維，采用多種顯微鏡觀察制備的平板膜和中空纖維結構，著重分析L02細胞在PES平板膜和中空纖維上的形態(tài)、生長曲線、白蛋白合成、LDL攝取、生物轉化等功能，

5、以評價制備的PES平板膜和中空纖維對肝細胞粘附、生長、增殖和功能表達的支持效果。 應用一步發(fā)泡技術制備聚氨酯多孔支架材料，并與商品化的殼聚糖、聚乳酸-聚羥乙酸酯三維支架材料對比，根據材料的肝細胞相容性、孔隙率、孔徑、和物理特性等，確定用于生物反應器構建的三維支架材料，在此基礎上，進一步采用鼠尾膠原或纖維蛋白凝膠進行優(yōu)化培養(yǎng)，以提高該支架材料對肝細胞培養(yǎng)的支持效果。 在上述研究的基礎上，構建PES中空纖維和聚氨酯多孔支架雜

6、交的三維立體式生物反應器。利用血漿循環(huán)評價該反應器的物質傳輸能力；通過纖維蛋白凝膠進行反應器內肝細胞的凝膠化培養(yǎng)，觀察反應器內培養(yǎng)肝細胞的形態(tài)和分布，檢測凝膠化反應器內肝細胞功能的表達，以評價反應器的性能；采用體外人工肝實驗評價生物反應器對重型肝炎病人血漿的肝支持作用。 本實驗的主要研究結果如下： 1.在各種膜材料上培養(yǎng)L02細胞的LDH漏出量與對照組無顯著差異，提取的細胞DNA電泳未見DNALadder。細胞在PES膜

7、上的貼壁率顯著高于CA、PVDF、PP、CNA膜，與對照組和PSF膜無顯著差異，PSF膜顯著低于對照組；PES膜上貼壁細胞數明顯較CA和CNA膜多，形態(tài)典型。PES和PSF膜上細胞DNA總量與對照組無顯著差異，顯著高于CA、PP、CNA膜，PVDF膜上細胞DNA總量顯著低于對照組；在7天的培養(yǎng)時間內，PES膜上和對照組的細胞活性最高，顯著高于CA、PVDF、PP、CNA膜。PES膜上培養(yǎng)L02細胞合成的細胞總蛋白與對照組無顯著差異，顯著

8、高于其它膜材料；各種膜材料上培養(yǎng)L02細胞CYP1A2活性均高于對照組。 2.制備的PES平板膜和中空纖維的橫截面由大量縱向排列的指狀孔構成，指狀孔開口于外表面形成有大量微孔的粗糙面，封閉于的內表面形成致密層和光滑面。PES膜上L02細胞的生長曲線典型，在8d的培養(yǎng)時間能增殖6至7倍，中空纖維上培養(yǎng)的L02細胞可長滿中空纖維表面；細胞在PES膜和中空纖維上粘附呈多細胞聚集生長，可覆蓋材料表面，部分細胞延伸入表面微孔內。PES膜和

9、中空纖維上培養(yǎng)細胞LDH漏出量與對照無顯著差異。PES膜和中空纖維上培養(yǎng)L02細胞的白蛋白合成量持續(xù)升高，在第8天反超對照組細胞；在DiI-Ac-LDL攝取實驗中，PES膜和中空纖維上培養(yǎng)L02細胞內紅色熒光強度與對照無明顯差異，在戊醚試鹵靈轉化實驗中，PES膜和中空纖維上培養(yǎng)L02細胞內紅色熒光強度比對照組高。 3.制備出高孔隙率和有彈性的聚氨酯多孔支架材料，殼聚糖易塌陷變形，聚乳酸-聚羥乙酸酯質地較硬，提示聚氨酯更容易與中空

10、纖維組合。L02細胞在聚氨酯和殼聚糖支架材料內的細胞接種率顯著高于聚乳酸-聚羥乙酸酯，殼聚糖內的細胞接種率最高；L02細胞在聚氨酯和聚乳酸-聚羥乙酸酯內均粘附微孔壁生長，在聚氨酯內分布更均勻，在殼聚糖內呈多細胞聚集生長；聚氨酯和殼聚糖內培養(yǎng)L02細胞的活性和白蛋白合成量顯著高于聚乳酸-聚羥乙酸酯，聚氨酯和殼聚糖之間無顯著差異。鼠尾膠原被覆組和對照組的L02細胞均在聚氨酯材料微孔內貼壁生長，鼠尾膠原被覆組的貼壁細胞數量明顯高于聚氨酯對照組

11、，纖維蛋白凝膠組培養(yǎng)的L02細胞均勻分布在材料微孔內，呈多細胞球形體生長；纖維蛋白凝膠組L02細胞的活性在7d內顯著升高，在3、5、7d均顯著高于聚氨酯對照組和纖維蛋白凝膠組；纖維蛋白凝膠組L02細胞的白蛋白合成量逐漸升高，在培養(yǎng)的第5和7d顯著高于鼠尾膠原被覆組和聚氨酯對照組。 4.以單內皮層PES中空纖維和聚氨酯材料為骨架構建出雜交型三維立體式生物反應器。在物質傳輸實驗中，雜交型生物反應器內外腔總膽紅素和白蛋白濃度達到平衡分

12、別需10min和15min，與對照組無明顯差異，凝膠化雜交型反應器內總膽紅素和白蛋白濃度達到平衡較對照組延緩5min，但30min內能完全達到平衡，提示構建的反應器具有良好的物質傳輸能力，凝膠化對反應器物質傳輸的無顯著影響。凝膠化培養(yǎng)反應器內肝細胞呈球形體生長，較對照組分布更均勻；反應器凝膠化培養(yǎng)可恢復肝細胞CYP3A4和UGT1AmRNA的表達；凝膠化反應器內肝細胞的白蛋白合成、尿素合成、氨清除率均持續(xù)穩(wěn)定上升，在培養(yǎng)后期顯著高于對照

13、組，LDH漏出量較對照組更低，有較強的CYP1A2活性；凝膠化反應器內重型肝炎病人血漿循環(huán)實驗發(fā)現，經6h的體外循環(huán)，病人血漿中總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、總膽汁酸、氨等的含量均顯著降低。在循環(huán)病人血漿中ALT、ALP、GGT等酶無顯著影響，但AST和LDH持續(xù)升高。 以上結果提示： ①在PES、PSF、CA、PVDF、PP、CNA等半透膜材料中，PES是肝細胞相容性最佳的半透膜材料，適宜用于生物反應器中空纖維的制

14、備。 ②制備的PES平板膜和中空纖維具備單內皮層、指狀孔、外表面粗糙、內表面光滑、非對稱性的特點，能夠較好的支持肝細胞的粘附、生長、增殖和功能的表達。 ③制備出高孔隙率有彈性的聚氨酯支架材料，與肝細胞有較好的細胞相容性，纖維蛋白凝膠能有效優(yōu)化聚氨酯材料內肝細胞培養(yǎng)條件，提高培養(yǎng)肝細胞活性和功能的穩(wěn)定表達。 ④成功的構建出雜交型三維立體式生物反應器，該反應器具有良好的物質傳輸能力，凝膠化生物反應器能夠培養(yǎng)大量、高密