人肝細胞型體外生物人工肝支持系統(tǒng)的實驗研究.pdf

1、各種原因?qū)е碌母嗡ソ呤殖Ｒ?，?nèi)科綜合治療療效差.人工肝支持系統(tǒng)是治療肝衰竭的重要方法之一，以培養(yǎng)肝細胞為核心的生物人工肝可暫時替代肝臟功能，清除有害物質(zhì)，補充生物活性物質(zhì)。目前用于臨床研究的肝細胞材料主要有豬肝細胞、從HepG2細胞獲得的C3A細胞系。采用C3A細胞的ELAD生物人工肝臨床研究顯示對肝衰竭患者有一定療效，但治療過程中有出血、過敏，凝血等不良反應(yīng).為完善肝細胞的功能，本課題將人肝再生增強因子(hALR)應(yīng)用于生物人工肝細

2、胞材料中，構(gòu)建體外生物人工肝支持系統(tǒng)(BLASS)，以期增強肝細胞分泌肝再生增強因子的能力，提高生物人工肝的療效。
　　 1.pcDNA3.1(-)hALR重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定ALR是一種熱穩(wěn)定細胞因子，它能促進肝細胞增殖和肝臟再生、抑制NK細胞活性，對受損的肝細胞具有很強的保護作用.本試驗從肝組織中提取RNA，RT-PCR擴增出hALR片段，克隆至真核表達載體pcDNA3.1(-)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)hALR，

3、經(jīng)測序、雙酶切等方法鑒定，符合應(yīng)用要求。
　　 2.hALR肝細胞系的建立及功能評價采用有限稀釋法和利多卡因轉(zhuǎn)化等方法篩選HepG2細胞，挑選出一株生長旺盛、有一定利多卡因代謝功能的細胞，然后轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)hALR，經(jīng)G418篩選，在體外培養(yǎng)50代后，進一步對其合成、代謝、解毒等功能評價.結(jié)果顯示：該細胞系功能穩(wěn)定，形態(tài)良好，生長旺盛，24h利多卡因轉(zhuǎn)化率65％，安定轉(zhuǎn)化率79.33％。間接免疫熒光實驗證實h

4、ALR在肝細胞胞漿中大量存在。轉(zhuǎn)染后的肝細胞生長速度、白蛋白合成能力等均較轉(zhuǎn)染hALR之前肝細胞有所增強。培養(yǎng)72h后，肝細胞上清液中AFP可升高至118.0±56ng/ml.免疫斑點印跡法檢測到其培養(yǎng)上清液中ALR蛋白水平升高。另外該肝細胞系可在體外大量、快速增殖，基本符合生物人工肝細胞材料的要求。
　　 3.hALR肝細胞系的生物反應(yīng)器培養(yǎng)用已建立的hALR肝細胞系為細胞材料，以費森尤斯公司的P2S血漿濾過器為中空纖維反應(yīng)器

5、，反應(yīng)器中預(yù)先裝入存活率95％以上、總量1×108個肝細胞。用管路連接蠕動泵、肝細胞培養(yǎng)液等，構(gòu)建生物反應(yīng)器體外培養(yǎng)系統(tǒng)，對肝細胞在反應(yīng)器中的生長及功能進行評估.結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)保持完整，并有一定的合成白蛋白、甲胎蛋白、尿素氮等作用.培養(yǎng)72h后細胞數(shù)升至7.60×108，96h后為9.02×108，細胞存活率分別為92％和95％，在倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察下可見細胞能較好粘附在中空纖維上.24h利多卡因轉(zhuǎn)化率88.4％，細胞培養(yǎng)液的細

6、菌和支原體檢測均未發(fā)現(xiàn)異常。
　　 4.離線型生物人工肝支持系統(tǒng)的構(gòu)建及對肝衰竭患者血漿體外治療的初步研究我們采用“離線”方法，在體外對血漿置換后廢棄血漿進行膽紅素吸附，然后采用血漿代替培養(yǎng)液，對生物反應(yīng)器中hALR肝細胞進行培養(yǎng)，充分利用肝細胞的代謝、解毒和合成功能。結(jié)果顯示：治療前血漿TBil為332.22±22.54umol/L，膽紅素吸附后TBil為295.6±128.7μmol/L(P<0.01)，白蛋白、BUN、血糖

7、等變化無顯著性差異。離線生物人工肝治療前血漿中TBil、AFP和白蛋白值分別是295.6±128.7μmol/L，21.2士17.5ng/ml和26.44±2.186 g/L，經(jīng)4～6h治療后，上述指標分別為239.4±103.9μmol/L(P<0.05)，102±62.8ng/ml(P<0.01)和32.44±2.29g/L(P<0.05)。結(jié)果提示本離線型生物人工肝支持系統(tǒng)具有降低膽紅素，增加白蛋白、尿素、AFP的合成等作用。