骨組織工程支架材料nHA-BC的細(xì)胞相容性和組織相容性研究.pdf

1、骨缺損或病變的修復(fù)是當(dāng)前骨科領(lǐng)域研究的重要課題:組織工程的發(fā)展為骨疾病的治療提供了全新的思路,骨組織工程利用工程材料學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法制造新的骨組織,以修復(fù)和替代病變或缺損的骨組織。自然骨無(wú)機(jī)相的主要組成成分是納米級(jí)的羥基磷灰石(nHA),但其強(qiáng)度低,韌性差；細(xì)菌纖維素(Bacterial cellulose,BC)是一種具有三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的天然的生物材料,具有很好的生物活性、生物可降解性及生物適應(yīng)性,并有獨(dú)特的物理、化學(xué)和機(jī)械

2、性能。將這兩種材料結(jié)合起來(lái)的nHA/BC復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)特征類似于骨骼中的生物磷灰石,不僅具有足夠的強(qiáng)度,還具有骨傳導(dǎo)功能,支持骨細(xì)胞在支架上的粘附和繁殖,是一種很有前景的骨組織工程納米復(fù)合支架材料。
　　 作為一種新型生物醫(yī)用材料,其生物相容性是首要考慮的問(wèn)題。本文主要從體外和體內(nèi)兩方面對(duì)組織工程用支架基體材料細(xì)菌纖維素(BC)及其復(fù)合材料納米羥基磷灰石/細(xì)菌纖維素(nHA/BC)進(jìn)行了細(xì)胞相容性和組織相容性的研究。
　　

3、 我們首先提取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)并誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞以備進(jìn)行后續(xù)體外試驗(yàn)。體外試驗(yàn)包括用MTT比色法檢測(cè)材料細(xì)胞毒性的試驗(yàn)及采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和電鏡評(píng)價(jià)材料的相容性試驗(yàn)。采用MTT比色法進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)原始材料及不同時(shí)間點(diǎn)得到的纖維素酶降解殘留物的細(xì)胞毒性；采用流式細(xì)胞術(shù)和電鏡觀察方法評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞相容性(兩種材料及其酶降解殘留物與細(xì)胞接觸后分別分析細(xì)胞周期比例的變化以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化)。體內(nèi)試驗(yàn)是對(duì)這兩種材

4、料進(jìn)行亞急性毒性試驗(yàn)和骨植入試驗(yàn)。亞急性毒性試驗(yàn)是通過(guò)尾靜脈注射的方式進(jìn)行,對(duì)大鼠尾靜脈連續(xù)注射這兩種材料的浸提液2周后處死解剖,主要觀察指標(biāo)包括動(dòng)物飼養(yǎng)期間體重變化、血液生化指標(biāo)、臟器系數(shù)和臟器病理變化等；體內(nèi)骨植入試驗(yàn)是將材料植入新西蘭大白兔股骨干垢端缺損部位,觀察植入材料后的大白兔的大體情況,并對(duì)植入部位制作組織切片進(jìn)行組織學(xué)觀察。
　　 本研究細(xì)胞毒性結(jié)果顯示BC和nHA/BC及其酶降解后的殘留物分別直接作用于L929細(xì)

5、胞和成骨細(xì)胞2天和4天后,細(xì)胞增值率均在80％以上,細(xì)胞毒性等級(jí)均在0-1級(jí)之間,表明無(wú)細(xì)胞毒性,且兩種細(xì)胞與材料作用后,RGR值具有差異性,成骨細(xì)胞作為靶細(xì)胞對(duì)材料的敏感性更高；BC和nHA/BC及其酶降解后的產(chǎn)物分別直接作用于L929細(xì)胞和成骨細(xì)胞后,細(xì)胞周期比例大部分均處于G0/G1期,表明細(xì)胞仍是正常的二倍體,未出現(xiàn)異倍體,材料無(wú)致瘤致癌性,并且細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化,從形態(tài)上分析基本上無(wú)凋亡細(xì)胞出現(xiàn),證明原始材料及酶解殘留物具

6、有較好的細(xì)胞相容性。另外,原材料及其降解產(chǎn)物作用于成骨細(xì)胞后,G0/G1期比例減少,而S期和G2/M期比例增加,表明材料能增加成骨細(xì)胞DNA的合成,促進(jìn)成骨細(xì)胞分裂增殖,有利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。將兩種原始材料浸提液經(jīng)尾靜脈連續(xù)14天注射入大鼠后,雌性大鼠的臟器系數(shù)和血液生化指標(biāo)對(duì)材料浸提液的敏感性大于雄性大鼠；另外BC浸提液對(duì)大鼠腦系數(shù)、腎臟系數(shù)、中間細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量的影響與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而大鼠的臟器病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明受兩種材料

7、浸提液作用后的大鼠臟器病理學(xué)未見明顯異常。表明BC和nHA/BC都沒(méi)有明顯的體內(nèi)全身亞急性毒性；大白兔股骨干垢端植入材料后,其大體狀況良好,材料植入股骨1m后材料未見降解,組織學(xué)切片可見材料長(zhǎng)入骨髓腔內(nèi),并見材料周圍有一團(tuán)形包囊,包囊內(nèi)有炎癥反應(yīng),包囊和股骨內(nèi)側(cè)相鄰部位略有骨小梁增生,材料植入股骨干垢端3m和6m后材料有小部分降解,其中6m組的肉眼可見降解,其組織學(xué)切片未見明顯炎癥反應(yīng),且材料周圍有“骨樞”形成?？梢?植入時(shí)間越長(zhǎng),材料