基于STR自動檢測系統(tǒng)對DNA在血清、尿液和唾液中降解動力學(xué)的測定.pdf

1、背景:
　　循環(huán)DNA(circulating DNA)是存在于血清、血漿、唾液、尿液、腦脊液、前列腺液等體液中游離于細(xì)胞外的DNA。由于循環(huán)DNA在腫瘤、心肌梗死以及胎兒產(chǎn)前診斷中有重要的診斷價值，對其檢測亦有“液體活檢”之稱。但是，循環(huán)DNA本身是自然降解的，并且其檢測是一個多步驟的過程，從標(biāo)本采集直到檢測分析，其中的每一步都可能對檢測結(jié)果產(chǎn)生重要的影響。在本課題中，我們通過對分別位于16條常染色體和性染色體上共20個STR位

2、點的分析，研究了不同溫度條件下DNA在血清、尿液以及唾液中降解為77～446 bp的小片段的半衰期情況，并且初步探討了尿液對DNA的降解機(jī)制，從而，對體液標(biāo)本采集后到提取前的放置時間、條件以及擴(kuò)增子大小對檢測結(jié)果的影響進(jìn)行了初步的討論。
　　方法:
　　于體液中分別加入“裸DNA”和DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，在室溫和37℃條件下孵育一定時間，應(yīng)用全自動核酸提取儀，采用磁珠法對降解的系列體液標(biāo)本統(tǒng)一進(jìn)行DNA提取，同時，采用法醫(yī)學(xué)

3、實驗室親子鑒定技術(shù)對所提取DNA的20個短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)位點進(jìn)行擴(kuò)增分析，探討了不同體液中高分子量基因組DNA降解為77～446 bp的小分子片段的半衰期情況。同時，我們通過在尿液中加入EDTA、將尿液高溫高壓處理以及配制與尿液中尿素濃度相當(dāng)?shù)哪蛩厝芤旱姆椒?，研究尿液中的酶類、耐高溫成分以及尿素對DNA降解的影響。
　　結(jié)果:
　　1.DNA在血清中降解動力學(xué)的測定結(jié)果
　　“裸DNA”和DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物在

4、室溫及37℃條件下符合一級動力學(xué)規(guī)律，相應(yīng)的半衰期如下:在室溫條件下，“裸DNA”和DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物在血清中的降解半衰期分別為71.4 min和346.5 min;在37℃條件下，兩種形式核酸的降解半衰期分別為26.8 min和157.5 min。
　　2.唾液DNA降解動力學(xué)測定結(jié)果
　　在室溫和37℃條件唾液DNA降解符合一級動力學(xué)規(guī)律，相應(yīng)的半衰期分別為253.2 min和172.9 min。
　　3.尿液對

5、DNA的降解作用結(jié)果
　　尿液對DNA的降解作用極強(qiáng)，我們采用加入DNA降解一半時所對應(yīng)的尿液稀釋倍數(shù)來反映尿液對DNA的作用。發(fā)現(xiàn)，“裸DNA”在尿液中降解極快，其降解一半時所對應(yīng)的尿液稀釋倍數(shù)為6.9，而DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物降解一半對應(yīng)的稀釋倍數(shù)為4.4。
　　4.尿液中導(dǎo)致DNA降解成分的初步分析結(jié)果
　　尿液中的耐熱成分對DNA降解有著非常重要的作用，其次，尿素也對DNA降解有一定的作用，而EDTA可以部分抑制

6、尿液對DNA的降解作用，
　　結(jié)論:
　　1.“裸DNA”和DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物在血清中的降解符合一級動力學(xué)規(guī)律，在室溫條件下降解半衰期約為1h和6 h;而在37℃條件下的半衰期約為0.5 h和2.5h。
　　2.唾液DNA降解符合一級動力學(xué)規(guī)律，在室溫和37℃條件下的半衰期約為4h和3h，同時，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物在血清中的降解情況與唾液DNA的降解也較為相似。
　　3.與血清和唾液相比，尿液對DNA的降解作用