腸桿菌enterobacter.spcn1產氫代謝調控及其產氫相關基因的研究

1、IIII摘要隨著化石能源的日益短缺和環(huán)境保護要求的逐漸提高，氫能源作為清潔、高效的可再生能源越來越受到人們的重視。制取氫氣的方法多種多樣，例如物理制氫、化學制氫和生物制氫。發(fā)酵生物制氫成為生物制氫技術的最佳選擇是因為它具有產氫能力高、穩(wěn)定性好、可實現廢物處理資源化等優(yōu)點。然而，自然界中野生菌株產氫效率低一直是厭氧發(fā)酵產氫工業(yè)化亟待解決的關鍵問題，所以應用分子生物學的手段對菌種及其代謝途徑的改造就顯得非常有必要。目前通過基因工程和產氫代謝

2、調控手段改造產氫微生物是生物制氫領域的研究熱點。本文以高效產氫細菌腸桿菌Enterobacter.spCN1為主要研究對象，對其產氫代謝途徑中的相關基因進行了以下研究：從甲酸代謝產氫途徑考慮，利用基因工程和代謝工程來阻斷菌株Enterobacter.spCN1中產氫競爭代謝從而提高產氫量。乳酸是腸桿菌Enterobacter.spCN1厭氧發(fā)酵丙酮酸代謝產氫的主要副產物。首先構建乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenaseLDH

3、)基因敲除片段，然后通過運用噬菌體λRed同源重組方法，獲得了乳酸脫氫酶基因缺失重組菌株。CN1△ldhA工程菌利用葡萄糖產氫比野生菌CN1的產氫量增加17.3%，在利用丙酮酸鈉和甘油產氫時比野生菌CN1的產氫量增加18.1%和增加1.8倍。從NADH途徑產氫途徑考慮，通過阻斷NADH的消耗，提高NADHNAD進而提高產氫。通過運用同源重組方法分別構建乙醇脫氫酶(AlcoholdehydrogenaseAdh)缺失重組菌和延胡索酸還原酶

4、（fumaratereductase，Frd）缺失重組菌和NADH脫氫酶（NADHdehydrogenaseNuo）缺失重組菌。相對野生菌CN1的產氫量的變化為：CN1△adhE產氫減少41.3%，CN1△frd增加12.6%，CN1△Nuo增加21.4%。結合甲酸代謝產氫和NADH途徑產氫構建了乳酸脫氫酶基因和延胡索酸還原酶雙缺失重組菌以及乳酸脫氫酶基因和NADH脫氫酶（NADHdehydrogenaseNuo）雙缺失重組菌。雙敲除菌

5、在厭氧生長條件都受到一定的抑制，其中CN1△ldhA△frd的生長被抑制程度更明顯一些。兩個雙敲除菌產氫量分別增加了32.5%和24.5%。說明結合甲酸途徑產氫和NADH途徑產氫能夠進一步提高產氫能力。最后對Enterobactersp.CN1產氫相關基因的進行研究。克隆丙酮酸代謝中非常關鍵的丙酮酸甲酸裂解酶及其激活酶基因和氫酶大小亞基基因并且構建了共表達載體。并對氫酶大亞基基因進行了敲除實驗，驗證了氫酶大亞基在產氫過程是一種關鍵的酶。