表面蛋白EF0591對(duì)致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05部分生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、腸球菌是一種條件致病菌，常棲居于人和動(dòng)物消化道內(nèi)，腸球菌不僅能引起人類感染，而且豬、牛、羊、禽、貓、犬等也是易感動(dòng)物，并且能在人與動(dòng)物之間水平傳播。當(dāng)人體免疫力低下或腸球菌定植部位改變時(shí)，能引起人類疾病，如菌血癥、尿路感染、肝膽膿毒癥、心內(nèi)膜炎、外科傷口感染、牙髓感染、新生兒膿血癥等甚至危及生命。腸球菌的致病性與其毒力因子密切相關(guān)，有研究表明，當(dāng)腸球菌缺少某些毒力因子時(shí),其毒力將大大降低。因此，研究腸球菌的毒力因子對(duì)研究腸球菌的致病機(jī)制

2、具有重要的意義。EF0591是新近發(fā)現(xiàn)的一種毒力因子，有研究證明它與臨床分離株密切相關(guān)，但是人們關(guān)于它毒力及作用機(jī)制還知之甚少。本研究以致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05（E. faecalis XJ05）為親本株，構(gòu)建EF0591基因突變株（E. faecalis XJ05-△0591），培養(yǎng)HeLa及小鼠RAW264.7細(xì)胞，觀察突變?cè)摶蚝髮?duì)HeLa細(xì)胞的粘附能力、小鼠RAW264.7細(xì)胞的侵染能力、小鼠主要臟器的載菌能力以及對(duì)生物膜形成

3、能力的影響。發(fā)現(xiàn)E. faecalis XJ05在細(xì)胞黏附、侵染能力方面都比E. faecalis XJ05-△0591強(qiáng)；E. faecalis XJ05在小鼠肝、心、腎、脾內(nèi)的載菌量均顯著多于E. faecalis XJ05-△0591，在腦中無明顯變化；E. faecalis XJ05生物膜的形成量較E. faecalis XJ05-△0591多，且形態(tài)結(jié)構(gòu)更加致密。
　　主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1、E. fae

4、calis XJ05 EF0591基因突變株的構(gòu)建：應(yīng)用同源重組技術(shù)，利用PCR擴(kuò)增出用于突變 E. faecalis XJ05 EF0591基因片段，酶切、回收該基因片段，并與酶切的穿梭質(zhì)粒進(jìn)行連接，電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的E. faecalis XJ05中。應(yīng)用卡那霉素抗性篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，并采用PCR等方法進(jìn)行鑒定。最終成功得到基因突變株E. faecalis XJ05-△0591，經(jīng)過37℃連續(xù)傳代培養(yǎng)檢測(cè)證明該突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定

5、性。
　　2、EF0591在E. faecalis XJ05的細(xì)胞黏附、侵染及小鼠臟器載菌量影響研究：向培養(yǎng)好的HeLa細(xì)胞中加入菌懸液孵育1h和2h，裂解細(xì)胞后進(jìn)行計(jì)數(shù)；向培養(yǎng)好的RAW264.7細(xì)胞中加入菌懸液，培養(yǎng)1h后加入雙抗，繼續(xù)培養(yǎng)3h和24h，裂解細(xì)胞后進(jìn)行計(jì)數(shù)；將制備好的菌懸液腹腔注射小鼠，在不同時(shí)間取小鼠，取肝臟、腎臟、脾臟、心臟和腦組織進(jìn)行勻漿，勻漿液涂平板計(jì)數(shù)。以野毒株為對(duì)照，E. faecalis XJ05

6、-△0591對(duì)HeLa細(xì)胞黏附數(shù)量下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異顯著（P＜0.05）。對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞的侵染數(shù)量下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異顯著（P＜0.05）。E. faecalis XJ05-△0591在小鼠肝小葉、心臟、脾臟和腎臟中的載菌量下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異顯著（P＜0.05）；在腦組織中細(xì)菌數(shù)量有變化，但差異不顯著。
　　3、EF0591對(duì)E. faecalis XJ05生物膜形成影響的研究：E. faecalis XJ05-△

7、0591及E. faecalis XJ05親本株分別在相同條件下、于96孔板中、37℃恒溫箱中培養(yǎng)，經(jīng)PBS清洗并干燥，結(jié)晶紫染色后測(cè)其不同時(shí)間點(diǎn)的OD595值。將突變株和野毒株置于放有細(xì)胞爬片的六孔板中，37℃恒溫箱中培養(yǎng)，分別用結(jié)晶紫和FITC-ConA及PI染液染色，在光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)的生物膜。在不同時(shí)間所測(cè)得的OD595值顯示，E.faecalisXJ05-△0591形成的生物膜在6h形成明顯，24h

8、達(dá)到最大，24h后逐漸開始降解，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生物膜形成量都明顯低于E. faecalis XJ05親本株，且差異顯著（P＜0.05）。光學(xué)顯微鏡觀察E. faecalis XJ05-△0591及E. faecalis XJ05形成的生物膜形態(tài)發(fā)現(xiàn)E. faecalis XJ05形成的生物膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較多，形態(tài)較致密，膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)也更多。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)E. faecalis XJ05與E. faecalis XJ05-△0591相比