小麥WK蛋白激酶互作候選蛋白的初步驗證及其分子生物學特性分析.pdf

1、高等植物在生長過程中經常受到干旱、高溫、低溫、高鹽等非生物的脅迫，植物能夠快速感知這些不良環(huán)境的變化且主動適應，而適應的過程就涉及到細胞內與細胞間的信號傳遞。蛋白質的磷酸化和去磷酸化是生物體內能量代謝以及信號傳遞中的重要生化反應，而蛋白質的磷酸化主要是在蛋白激酶的催化下完成的。對小麥蛋白激酶的研究將為小麥的生理代謝和耐脅迫性的機制提供有利的依據。本實驗以小麥中蛋白激酶WK為誘餌通過酵母雙雜交篩選得到WD40和MAPK3蛋白，主要驗證WK

2、與WD40和MAPK3之間的相互作用，并對WD40和MAPK3分別進行了表達特性分析、組織特異性分析以及亞細胞定位分析，主要獲得的研究結果如下:
　　 (1)將WD40與MAPK3的全長基因分別構建到了pGADT7載體上，WK構建到pGBKT7的載體上，進行酵母雙雜交驗證其互作，結果在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal顯藍板上有菌落生長并顯蘭，經過測序比對證明是陽性克隆，表明WD40、MAPK3和WK在

3、酵母體內是互作的。
　　 (2)小白麥經過低溫、干旱、ABA、NaCl脅迫處理后，以各處理小白麥的cDNA為模板對WD40進行了瞬時表達分析，經過ABA、干旱、NaCl、MeJA脅迫處理小白麥后，以各個處理后小白麥的cDNA為模板對MAPK3進行了瞬時表達分析。結果表明干旱在轉錄水平上對WD40有明顯的上調作用，在轉錄水平上MAPK3對ABA，NaCl脅迫有強烈的響應。
　　 (3)分別將WD40與MAPK3構建到了綠色

4、熒光蛋白GFP上，利用基因槍介導法轟擊洋蔥表皮，培養(yǎng)后在熒光聚焦顯微鏡下觀察定位情況，用GFP做的空對照在整個細胞內都有信號，而WD40只有在細胞核中才能看到熒光，MAPK3在細胞膜和細胞核中都能看到，結果表明WD40定位在細胞核中，MAPK3定位在細胞膜和細胞核上。
　　 (4)將WD40與MAPK3分別構建到了真核表達載體PBI121上，并轉到了農桿菌C58Cl中，運用農桿菌侵染花序法將WD40與MAPK3轉到野生型擬南芥中