分子生物學基因組、轉錄組、蛋白組

1、Molecular Genetics and GenomicsFall Semester, 2010主講教師：薛樹林 聯(lián)系電話：84396024地址： 金陵研究院316E-mail: xsl@njau.edu.cn植物應用基因組學與生物信息中心,1. 出勤及回答問題情況： 30% （ 隨機提問形式）2. 期末考試： 70% （閉卷）,考核方式,,對于選修《基因組學》課程的同學，采取寫一篇課程

2、論文的考核方式（70%）。2學分，周五 3-5節(jié)，教學樓B301,References,Genomes 2, Genomes 3 by Brown TAGene VIII, Gene IX by B. LewinJournals on Plant Molecular Genetics《現(xiàn)代分子生物學》，朱玉賢，李毅 著《基因組學》楊金水 著《分子克隆實驗指南》（第3版），薩姆布魯克（美）主編,,Chapter 1: Geno

3、mes, Transcriptomes and ProteomesChapter 2: Studying DNAChapter 3: Mapping GenomesChapter 4: Sequencing and Annotation of GenomesChapter 5: Eukaryotic Nuclear GenomesChapter 6: Genomes of Prokaryotes and Eukary

4、otic OrganellesChapter 7: Genome ExpressionChapter 8: Genome Evolution,Outline of this course,,Chapter 1:Genomes, Transcriptomes and Proteomes,基因組（Genome）：由德國漢堡大學威克勒教授于1920年首創(chuàng)，指生物的整套染色體所含有的全部DNA或RNA

5、序列。基因組是地球上每一物種具有的生物學信息的存儲庫?；蚪M學（Genomics）：由羅德里克于1986年首創(chuàng)，指研究生物的整個基因組，涉及基因組作圖、測序和功能分析的一門學科。,1. 概述,基因組所包含的生物信息的利用需要酶及其他參與基因組表達過程中一系列復雜生化反應的蛋白質的協(xié)同活性?；蚪M表達的最初產物是轉錄組，即那些含有細胞在特定時間所需生物信息、編碼蛋白質的基因衍生而來的RNA分子的集合。轉錄組由轉錄過程來維持?；蚪M

6、表達的第二個產物是蛋白質組，即細胞中那些決定細胞能夠進行生化反應的所有蛋白質組分。這是通過翻譯過程來完成的。,細胞的蛋白質庫,DNA由Johann Friedrich Miescher在1869年發(fā)現(xiàn), 這位瑞士生物學家當時在德國蒂賓根（Tubingen）工作。,2. DNA,2.1 Genes are made of DNA,奧地利神父孟德爾1865年根據(jù)7個碗豆性狀的實驗提出了遺傳因子假說，認為每個性狀由遺傳因子控制，并提出了遺傳因

7、子的分離與自由組合兩大遺傳規(guī)律。,證明基因由核酸 (DNA或RNA) 組成的3個著名實驗：①肺炎雙球菌的轉化試驗；②噬菌體感染實驗；③煙草花葉病毒的感染實驗。,A. 1928年，荷蘭細菌學家格里菲斯（Griffith）的肺炎雙球菌轉化實驗 Griffith在研究肺炎球菌時發(fā)現(xiàn)肺炎球菌有很多不同菌株，其中有一種菌株它的球菌有毒性，能引起小鼠得敗血病。這些有毒的球菌外面有保護作用的多糖膠狀莢膜，使它們可以不被宿主的正常保護

8、機構所破壞；當它們生長在培養(yǎng)基上時，每一個細菌長成一個明亮的光滑菌落，叫光滑型（S）菌株；另外一些菌株無莢膜，菌落粗糙，沒有毒性，不會引起疾病，叫R型菌株 。,(1),(2),(3),(4),這表明無毒性的R型活細菌在與被加熱殺死的S型細菌混合后，轉化成了有毒性的S型活細菌。這些轉化成的S型細菌的后代也是有毒性的S型細菌，可見這種性狀的轉化是可以遺傳的。1944年，艾弗里從S型活細菌中提取了DNA，蛋白質和多糖等物質，然后分別加入到培

9、養(yǎng)R型細菌的培養(yǎng)基中。結果發(fā)現(xiàn)只有加入DNA時， R型細菌才能轉化成S型細菌。通過上述研究表明，DNA是使R型細菌產生轉化的物質，所以DNA是遺傳物質。,B. 噬菌體感染實驗 噬菌體T2有一個蛋白質的外殼，DNA裹在其中。當噬菌體T2感染大腸桿菌時，它的尾部吸附在菌體上。然后，菌體內形成大量噬菌體，菌體裂解后，釋放出幾十個乃至幾百個與原來感染細菌一樣的噬菌體T2。構成蛋白質的氨基酸中，甲硫氨酸和半胱氨酸含有硫，DNA中不含S，所

10、以S只存在于T2噬菌體的蛋白質。相反，P主要存在于DNA中，至少占T2噬菌體含磷量的99％。Alfed Hershey和Martha Chase (1952)將宿主菌細胞分別放在含35S或含32P的培養(yǎng)基中。宿主細胞在生長過程中就被35S或32P標記上了。然后用噬菌體去感染分別被S或P標記的細菌，并在這些細菌中復制增殖。宿主菌裂解釋放出很多子代噬菌體，這些子代噬菌體也被標記上35S或32P。,接著，用分別被35S或32p標記的噬菌體去

11、感染沒有被放射性同位素標記的宿主菌，然后測定宿主菌細胞帶有的同位素。被35S標記的噬菌體所感染的宿主菌細胞內很少有35S，而大多數(shù) 35S出現(xiàn)在宿主菌細胞的外面。也就是說， 35S標記的噬菌體蛋白質外殼在感染宿主菌細胞后，并未進入宿主菌細胞內部而是留在細胞外面。被32p標記的噬菌體感染宿主菌細胞后，測定宿主菌的同位素，發(fā)現(xiàn)32p主要集中在宿主菌細胞內。所以噬菌體感染宿主菌細胞時進入細胞內的主要是DNA。由此可以得出結論：噬菌體注入

12、宿主菌細胞內的物質是DNA，釋放出來的是跟原先感染細菌細胞一樣的噬菌體?？梢娫谑删w的生活史中，只有DNA是聯(lián)系親代和子代的物質。,C. 煙草花葉病毒的感染實驗對病毒的研究逐漸深入以后，發(fā)現(xiàn)一些植物的病毒僅含有RNA沒有DNA。當用煙草花葉病毒（TMV）的RNA和蛋白質分別進行感染試驗，發(fā)現(xiàn)只有RNA才能誘發(fā)感染。RNA也是遺傳物質,RNA,,蛋白質,2.2 The structure of DNA,核苷酸,A. Nucleoti

13、des and polynucleotides,2’-脫氧核糖,多聚核苷酸,3’,5’-磷酸二酯鍵,DNA多聚核苷酸合成的聚合反應,2.2 The structure of DNA,B. The model of double helix,DNA晶體X射線衍射圖譜為揭示DNA分子的二級結構提供了重要實驗證據(jù),a. Watson and Crick (1953) 提出的DNA雙螺旋結構模型：DNA分子通常以右手雙螺旋形式存在，兩條

14、核苷酸鏈反向平行，且互為互補鏈。戊糖－磷酸骨架在分子的外鍘，在分子表面形成大溝和小溝，堿基堆積于螺旋內部.堿基間通過氫鍵相互連接，A和T以2個氫鍵配對，G和C以3個氫鍵配對.螺旋中相鄰堿基間相隔0.34nm，每10個堿基對螺旋上升一圈，螺距為3.4nm，直徑為2.37 nm。,Width 2.37 nm,3.4nm,4,3,1,4,2,5,6,盡管氫鍵使得雙鏈中的堿基間的配對具有特異性（只有互補的兩條鏈之間才能形成DNA雙鏈），但

15、其對于雙螺旋的總體上的穩(wěn)定性并無太大貢獻。核酸分子的穩(wěn)定性的根源在于堿基對之間的疏水堆積力。作為芳香族化合物，堿基的平面使其不能在自由溶液中與水分子形成氫鍵，即它們是疏水的。疏水效應使雙鏈DNA成為能量上最為穩(wěn)定的結構。盡管這種堆積作用在RNA中也存在，但其在雙鏈DNA中達到了最大化。,b. DNA雙螺旋結構的穩(wěn)定力：堿基間形成的氫鍵相鄰堿基間的疏水堆積力堿基相互作用的范德華力,c. DNA雙螺旋結構的類型:三種形態(tài)的DNA：

16、A-DNA, B-DNA, Z-DNA兩類：右手螺旋和左手螺旋,A,B,Z,DNA雙螺旋不同構象的特征,螺旋直徑,螺距,3. RNA and the Transcriptome,基因組表達的最初產物是轉錄組，即那些含有細胞在特定時間所需生物信息、編碼蛋白質的基因衍生而來的RNA分子的集合。轉錄組中的RNA分子以及其他來自非編碼基因的RNA都由轉錄過程產生。,3.1 The structure of RNA,,核糖,,A, C, G,

17、 U,穩(wěn)定性差主要以單鏈形式存在,依賴模板的RNA合成,DNA-dependent RNA polymerases,3.2 細胞內的RNA組分,一個典型的細菌細胞含有 0.05–0.10 pg的RNA，約占其總質量的6%。一個哺乳動物細胞，比細菌大得多，含有20–30pg RNA，但是只占細胞總質量的1%。,細胞內的RNA組分,核小RNA,核仁小RNA,微小RNA,短干擾RNA,所有生物,僅真核生物,核小RNA(SnRNA)：發(fā)現(xiàn)于

18、真核生物細胞核中，與前體mRNA剪接成成熟mRNA的過程相關。核仁小RNA（snoRNA）：發(fā)現(xiàn)于真核細胞核的核仁區(qū)，在rRNA分子的加工過程中起到核心作用（比如在某個核苷酸位點上加上一個甲基）。微小RNA（miRNA）和短干擾RNA（siRNA）：是調控個別基因表達的小RNA。,3.3 Processing of precursor RNA,末端修飾,剪接,剪切,化學修飾,pre-rRNApre-tRNA,RNA editing

19、,新的化學基團,3.4 The transcriptome,轉錄組雖然不到細胞總RNA的4%，卻是細胞中最重要的組分，因為它包含了基因組表達的下一個階段中所要使用的編碼RNA。轉錄組從不從頭合成（de novo），一個細胞通過細胞分裂誕生時就接收了其上一代的部分轉錄組，并維持一生。各蛋白質編碼基因的轉錄過程并不是導致轉錄組的合成，而是通過替換被降解的mRNA來維持轉錄組，并通過開閉不同的基因的表達來改變轉錄組的組成。,3.5 轉錄組

20、研究的方法,A. 通過序列分析研究轉錄組,研究轉錄組最直接的方法是將其中的mRNA轉變?yōu)閏DNA，并對所有cDNA克隆進行測序，再與基因組序列進行比較分析。還可以借助第二、三代測序技術直接對RNA進行測序。,3.5 轉錄組研究的方法,A. 通過序列分析研究轉錄組,基因表達系列分析（Serial analysis of gene expresion, SAGE）,SAGE技術不是研究完整的cDNA，它產生長度12bp的短序列，每一條都

21、代表了轉錄組中存在的一種mRNA。,技術基礎：412=16,777,216 bp，真核mRNA平均1500 bp，412相當于11,000個轉錄物，這比最復雜的轉錄組中存在轉錄物數(shù)目還多，因此12bp序列能夠代表某一種mRNA。,BsmF1是一種不常見的限制性內切酶，它不在其識別序列內部，而是在識別位點下游10-14個nt處切割。,SAGE,纖維素微粒,4bp,頻繁切割,洗脫去除,連接一個含有BsmF1識別序列的寡聚核苷酸,切下來的片段

22、被收集起來，頭尾相連以產生一個串聯(lián)體，進行測序分析。串聯(lián)體中的各個標簽序列信息被讀取并與基因組中的基因序列比對，從而可以分析哪些基因被轉錄，表達水平如何。,SAGE,3.5 轉錄組研究的方法,B. 通過微陣列或芯片分析來研究轉錄組,,探針：,原位合成并固化的寡聚核苷酸PCR產物cDNA,,優(yōu)點：可用于快速評估兩個或多個轉錄組間的差異。,109拷貝，過量,構成轉錄組的mRNA總體被反轉錄成一個cDNA的混合物，然后被標記，用于和芯片

23、或微陣列雜交。,3.5 轉錄組研究的方法,B. 通過微陣列或芯片分析來研究轉錄組,與基因中不同位置匹配的寡聚核苷酸鏈（包含20種左右）,探針標記效率雜交效率,玻璃片，尼龍膜,玻璃片，硅片,用不同的熒光來標記cDNA樣品，微陣列與兩個樣品同時雜交，可以減少由于試驗誤差引起的差異。,4. Proteins and the Proteome,基因組表達的第二個產物是蛋白質組，即細胞中那些決定細胞能夠進行生化反應的所有蛋白質組分。這些蛋白

24、質是通過翻譯那些組成轉錄組的mRNA分子而合成的。,Mol cell proteomics: 8.8Proteomics: 4.4,4.1 Protein structure,蛋白質和DNA分子一樣，是一個線性的無分支的多聚體。蛋白質中的單體亞單位稱為氨基酸。氨基酸形成的多聚體或多肽在長度上很少超過2000個單位。,氨基酸的一般結構,A. The four levels of protein structure,4.1 Prote

25、in structure,a. primary structure,A. The four levels of protein structure,4.1 Protein structure,b. secondary structure,指多肽采取的不同構象，由不同氨基酸之間形成的氫鍵所穩(wěn)定。?螺旋；?片層,A. The four levels of protein structure,4.1 Protein structure,b

26、. tertiary structure,是將多肽鏈的二級結構組分折疊成為三維構型而形成的。,它被各種化學力所穩(wěn)定：,A. The four levels of protein structure,4.1 Protein structure,d. quaternary structure,兩條或更多已形成三級結構的多肽鏈組合在一起形成一個多亞基蛋白質。,不是所有蛋白質都有四級結構；穩(wěn)定力包括：二硫鍵（穩(wěn)定）；

27、 氫鍵， 疏水作用（松散）,Nature, 27 NOV, 2008,B. 蛋白質的多樣性取決于氨基酸的多樣性,4.1 Protein structure,組成蛋白質的氨基酸在化學性質上有多樣性，因此蛋白質的功能也是多種多樣的。氨基酸的多樣性源于R基團。,氨基酸的R基團,非極性（疏水）,極性（親水）,帶負電荷,p19,帶正電荷,4.2 The proteome,蛋白質組包括了在特定時間存在于細胞中的所有蛋

28、白質。一個典型的哺乳動物細胞，如肝細胞中，含有10000～20000種不同的蛋白質，共有約 8 x 109 個蛋白質分子，重約0.5 ng，占細胞總重量的18-20%。各種蛋白質的拷貝數(shù)差別很大，最少的每個細胞中不足20000個，最多的可達1億個。每個細胞中拷貝數(shù)大于50000的蛋白質被認為含量較豐富，通常哺乳動物細胞中約有2000種蛋白質屬于此類，它們大多屬于管家蛋白。,4.2 The proteome,A. The link

29、between the transcriptome and the proteome,Genetic code,四個標點密碼子,4.2 The proteome,B. The genetic code is not universal,4.2 The proteome,B. 蛋白質組和細胞生化功能之間的聯(lián)系,基因組編碼的生物學信息最終由蛋白質表現(xiàn)。蛋白質能夠執(zhí)行各種生物學功能：,生物催化作用（酶）；結構（細胞骨架由蛋白質決定）；運

30、動（收縮蛋白）；運輸（血紅蛋白運輸血液中的氧）；調節(jié)細胞進程（信號蛋白、活化調節(jié)因子）；保護細胞個體（抗體）；儲藏功能（麥醇溶蛋白）。,4.3 蛋白質組研究的方法,A. 蛋白譜（表達蛋白質組學）,用來研究一個蛋白質組組成的特定技術。,蛋白譜基于兩項技術：蛋白電泳和質譜,a. 雙向電泳：,分子量,等電點：蛋白質的凈電荷為零時溶液的PH值。,等電聚焦,等電點,雙向凝膠電泳結果,,尋找差異表達點,b. MALDI-TOF (基質輔助激

31、光解吸電離飛行時間質譜),4.3 蛋白質組研究的方法,A. 蛋白譜,用于鑒定蛋白組中的蛋白質，最多可以分析出50個氨基酸長度的多肽，因此一個蛋白質可以通過胰酶將其消化后進行測定。一旦多肽片段被離子化，多肽的質量/電荷比就可以通過它在質譜儀中從電離源到檢測器的“飛行時間”來確定。通過質荷比能夠確認多肽片段的分子質量。計算機中含有一個由所研究的物種基因組編碼的每一個蛋白質經胰酶消化后各個片段的預計相對分子質量的數(shù)據(jù)庫，計算機通過比較數(shù)據(jù)

32、庫與檢測到的多肽片段的分子質量來確認最可能的初始蛋白質。,質量/電荷比,多肽通過來自激光的脈沖能量被電離化,柱腔,質量/電荷比,波譜數(shù)據(jù),計算機通過比較數(shù)據(jù)庫與檢測到的多肽質量來確認最可能的初始蛋白質。,4.3 蛋白質組研究的方法,B. 蛋白質印跡法（Western雜交）,Western雜交是將蛋白質電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質的檢測方法。其原理是：生物中含有一定量的目標蛋白。先從生物細胞中提取總蛋白或目標蛋白，將蛋白質

33、樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經SDS-PAGE電泳將蛋白質按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質條帶原位轉移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質溶液中溫育，以封閉其非特異性位點。,4.3 蛋白質組研究的方法,B. 蛋白質印跡法（Western雜交）,然后加入特異性抗體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結合后，再加入能與一抗專一性結合的帶標記的二抗（通常一抗用兔來源的抗體時，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白

34、抗體），最后通過二抗上帶標記化合物（一般為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，或用同位素或生物素標記）的特異性反應進行檢測。根據(jù)檢測結果，從而可得知被檢生物細胞內目的蛋白的表達與否、表達量及分子量等情況。,Western blotting,電泳印跡,4.3 蛋白質組研究的方法,C. 鑒定與某一蛋白質相互作用的蛋白質,通過鑒定有相互作用的成對或成組的蛋白質能夠獲得基因組活性相關的重要數(shù)據(jù)。構建蛋白質相互作用圖譜被視為是連接蛋白質組學與細胞生物

35、化學過程的一個重要步驟。,4.3 蛋白質組研究的方法,C. 鑒定與某一蛋白質相互作用的蛋白質,a. 噬菌體展示,該技術采用了一種基于?噬菌體或某種絲狀噬菌體的獨特的克隆載體。待測基因被插入載體后，它的蛋白質產物能與噬菌體外殼蛋白以融合形式表達。,噬菌體外殼蛋白基因,插入要展示的蛋白質的DNA,制備一種展示噬菌體,融合可讀框,使用噬菌體展示庫來尋找與待測蛋白質相互作用的蛋白質的噬菌體。,把待測蛋白質固定在微量滴定盤的孔中,b. 酵母雙雜

36、交,4.3 蛋白質組研究的方法,C. 鑒定與某一蛋白質相互作用的蛋白質,激活因子（轉錄因子）：一類控制基因表達的蛋白質，包含DNA結合結構域和轉錄激活結構域。雙雜交系統(tǒng)使用缺乏某一報告基因相應激活因子的釀酒酵母菌株，此時報告基因是不表達的。,轉化酵母后產生融合蛋白,待測基因,,一系列DNA片段混合物,,使用酵母雙雜交篩選相互作用的蛋白質,兩套克隆混合，共轉化酵母,,4.3 蛋白質組研究的方法,D. 蛋白質相互作用圖譜,也叫蛋白質相互作

37、用網絡，能展現(xiàn)一個蛋白質組中各成員間發(fā)生的相互作用。,釀酒酵母蛋白質相互作用圖譜（2001）,數(shù)據(jù)來自酵母雙雜交試驗,釀酒酵母蛋白質相互作用圖譜（2002）,數(shù)據(jù)來自酵母雙雜交試驗,The genome tells you what could be happened theoretically in the cell.Transcriptome tells you what might be happened.And th

38、e proteome tells you what is happening.,Summary,本章學習要點理解 Genomes, Transcriptomes 和 Proteomes三個名詞，并闡明它們在基因組表達過程中是如何聯(lián)系在一起的；理解基因由DNA（或RNA）組成的三個實驗；掌握雙螺旋結構的關鍵特征；正確區(qū)分編碼RNA和功能性RNA；描述蛋白質結構的不同層次；描述遺傳密碼的關鍵特征；掌握轉錄組學和蛋白質組學的一般研究方法，