切花菊轉(zhuǎn)DdICEl基因研究.pdf

1、菊花[Chrysanthemum grandiflorum(Ramat.)Kitamura]是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花、世界四大切花之一，在園林、家庭綠化美化中占有十分重要的地位。本研究將從異色菊中克隆得到的逆境誘導(dǎo)基因DdICE1的正義及反義植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，以目前生產(chǎn)應(yīng)用比較廣泛的切花菊品種‘神馬’無菌葉片為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行同源遺傳轉(zhuǎn)化研究。對(duì)轉(zhuǎn)基因后代逆境脅迫耐性(低溫、干旱、高鹽)進(jìn)行了鑒定，同時(shí)探討

2、了與脅迫耐性提高有關(guān)的基因表達(dá)量變化及生理生化指標(biāo)。主要研究結(jié)果如下：
　　 ⑴轉(zhuǎn)錄因子DdICE1基因轉(zhuǎn)化切花菊‘神馬’及轉(zhuǎn)基因植株的獲得。成功構(gòu)建了由CaMV35S驅(qū)動(dòng)DdICE1基因的正義及反義植物表達(dá)載體，將攜帶DdICE1基因的農(nóng)桿菌侵染切花菊‘神馬’成功實(shí)現(xiàn)了DdICE1對(duì)切花菊‘神馬’的同源轉(zhuǎn)化，通過對(duì)潮霉素篩選后初步得到抗性植株，對(duì)植株進(jìn)行PCR、半定量RT-PCR及熒光定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明DdICE1

3、的同源轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)了基因整合表達(dá)。共獲得了10株超量表達(dá)DdICE1的轉(zhuǎn)基因株系(Ti)及3株表達(dá)量比未轉(zhuǎn)化植株WT低的轉(zhuǎn)基因株系(TA1)。
　　 ⑵轉(zhuǎn)基因植株后代的耐性分析。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株后代逆境脅迫耐性(低溫、干旱、高鹽)進(jìn)行了初步鑒定，同時(shí)探討了與脅迫耐性提高有關(guān)的基因表達(dá)量變化及生理生化基礎(chǔ)。對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株(WT)進(jìn)行了低溫耐性分析，結(jié)果表明，在低溫脅迫下，與WT植株相比，過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系半致死溫度明顯較低

4、，而TRNAi2株系半致死溫度較高。選擇半致死溫度差異較大的Ti2、TAi2及WT植株進(jìn)行腳芽恢復(fù)生長(zhǎng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)化植株(WT)存活率分別為81.7％(-6℃)，46.7％(-9℃)，Ti2植株的存活率分別為93.3％(-6℃)，70％(-9℃)，而TAi2植株存活率分別為46.7％(-6℃)，23.3％(-9℃)，說明過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株(Ti2)耐低溫能力有了較大的提高。從表達(dá)量變化上看，轉(zhuǎn)基因株系和未轉(zhuǎn)化植株葉片中ICE1

5、基因及下游CgDREBa基因表達(dá)量均呈先升高再緩慢下降的變化趨勢(shì)，但Ti2植株CgDREBa基因表達(dá)量水平始終高于WT植株且在9 h時(shí)達(dá)到最高峰；而與WT植株相比，TAi2植株CgDREBa基因表達(dá)量一直處于很低的水平。另外，由ICE1基因和CgDREBa基因表達(dá)量水平變化趨勢(shì)相同可以推測(cè)，ICE1基因在低溫馴化條件下激活了了下游CgDREBa基因的表達(dá)，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)下游與耐寒相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高了植株耐寒性。從生理變化上看，脯氨

6、酸含量在低溫處理前(0h)轉(zhuǎn)基因株系及未轉(zhuǎn)化植株WT均處于較低且一致的水平，在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系及WT植株中脯氨酸含量水平隨時(shí)間均呈緩慢升高的狀態(tài)，而Ti2株系脯氨酸含量水平及幅度均明顯高于未轉(zhuǎn)化植株WT及TAi2植株。轉(zhuǎn)基因株系及WT植株中丙二醛含量的變化趨勢(shì)相似，丙二醛含量水平也隨時(shí)間均呈緩慢升高的狀態(tài)且Ti2株系明顯低于WT及TAi2植株。轉(zhuǎn)基因株系及WT植株中SOD和POD活性變化趨勢(shì)相似，但Ti2株系中SOD和POD活性水

7、平始終高于WT及TAi2植株。表明過量表達(dá)DdICE1的轉(zhuǎn)基因植株在低溫脅迫下的抗過氧化能力和抗?jié)B透脅迫能力較WT及TAi2植株有所增強(qiáng)。
　　 ⑶對(duì)轉(zhuǎn)基因株系及WT植株進(jìn)行干旱耐性分析時(shí)，結(jié)果顯示，Ti2植株的存活率為88.3％顯著高于WT植株(43.3％)及TAi2植株(11.7％)，表明Ti2轉(zhuǎn)基因株系的耐旱能力得到提高。從基因表達(dá)量上看，轉(zhuǎn)基因株系和WT植株葉片中ICE1基因及下游CgDEBa基因表達(dá)量均呈先升高再緩慢下

8、降的變化趨勢(shì)，且Ti2植株基因表達(dá)量水平始終明顯高于WT及TAi株，由ICE1基因和CgDREBa基因表達(dá)量水平變化趨勢(shì)相同可以推測(cè)，ICE1基因在脅迫條件下激活了了下游CgDREBa基因的表達(dá)，從而提高植株干旱脅迫耐性。從生理變化上看，轉(zhuǎn)基因植株Ti2的SOD、POD活性和脯氨酸含量都顯著高于WT及TAi植株，MDA的含量則低于WT及TAi2植株，表明過量表達(dá)DdICE1的轉(zhuǎn)基因植株受到干旱脅迫后抗氧化和抗?jié)B透脅迫能力得到提高，從而增

9、強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因切花菊的耐干旱脅迫能力。
　　 ⑷對(duì)轉(zhuǎn)基因株系及WT植株進(jìn)行耐鹽性分析時(shí)，結(jié)果顯示，Ti2植株的存活率(96.7％)明顯高于WT植株(61.7％)及TAi2植株(41.7％)，表明Ti2轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性得到提高。從基因表達(dá)量上看，隨著NaCl溶液濃度逐漸提高，Ti2、TAi2株系和WT植株葉片中ICE1基因及下游CgDREBa基因表達(dá)量均呈先升高再緩慢下降的變化趨勢(shì)，但Ti2植株基因表達(dá)量水平始終高于WT植株且在10

10、 d時(shí)達(dá)到最高峰；而與WT植株目比，TAi2植株基因表達(dá)量變化不明顯。ICE1和CgDREBa表達(dá)量水平變化趨勢(shì)相同可以推測(cè)，ICE1在鹽脅迫條件下激活了CgDREBa的表達(dá)，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)下游與耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)，提高植株耐鹽性。在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株Ti2的SOD、POD活性和脯氨酸含量都顯著高于WT及TAi2植株，MDA的含量則低于WT及TAi2植株，表明過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株受到鹽脅迫后抗氧化和抗?jié)B透脅迫能力得到提高，從而增強(qiáng)了DdI