植物OPR基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析及水稻OPR家族基因分子生物學(xué)功能研究.pdf

1、茉莉酸是植物體內(nèi)廣泛存在的一種植物激素，由亞麻酸經(jīng)十八烷碳烯酸代謝途徑合成的；它不僅作為內(nèi)源生長物質(zhì)，在植物的整個(gè)發(fā)育進(jìn)程中起調(diào)節(jié)作用，而且還作為局部和系統(tǒng)的信號分子參與生物和非生物逆境脅迫的應(yīng)答。12-氧-植物二烯酸還原酶(12-oxo-phytodienoic acid reductase，OPR)是茉莉酸生物合成即十八烷碳烯酸代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，控制茉莉酸合成的最后步驟。在植物基因組中，OPR屬于OYE家族，是黃素單核苷酸依賴

2、的氧化還原酶，并且以多基因家族形式存在。目前，盡管對擬南芥及其他物種的少數(shù)幾個(gè)OPR基因在生化和遺傳方面進(jìn)行研究并取得了一些重要結(jié)果，但是對于整個(gè)植物OPR基因家族的進(jìn)化及生物學(xué)功能(生化和生理功能)并不很清楚?；诖耍狙芯吭谒镜?染色體S5區(qū)基因注釋和研究基礎(chǔ)上，采取比較基因組學(xué)與現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合的研究策略，首先從整體層面上對植物OPR基因家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以探究植物OPR基因家族的起源、進(jìn)化及潛在的功能分化；其次

3、在植物OPR基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析基礎(chǔ)上，從局部層面上對水稻OPR家族基因進(jìn)行分子生物學(xué)研究，以探究水稻OPR家族基因的蛋白結(jié)構(gòu)、生化特性及可能的生理功能。
　　 1)在植物OPR基因家族系統(tǒng)發(fā)育方面：本研究采用綜合生物信息學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育的研究方法進(jìn)行比較基因組學(xué)研究，以探究植物OPR基因家族的系統(tǒng)發(fā)育、結(jié)構(gòu)進(jìn)化及可能的功能分化，取得了以下結(jié)果：
　　 ①利用公共數(shù)據(jù)庫資源，在植物基因組中鑒定了105個(gè)OPR基因；其中，在6

4、個(gè)不同譜系的11個(gè)代表性物種(藻類：萊茵衣藻和團(tuán)藻；苔蘚：小立碗蘚；蕨類：卷柏；裸子植物：云杉；單子葉植物：水稻、玉米和高粱；雙子葉植物：擬南芥、楊樹和苜蓿)中鑒定了74個(gè)OPR基因，均以多基因家族形式存在。
　　 ②通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，在植物基因組中，存在7個(gè)保守的OPR亞家族：其中，在水生植物中，僅存在一個(gè)OPR亞家族即sub.Ⅶ；而在陸生植物中，則存在六個(gè)OPR亞家族即subs.Ⅰ～Ⅵ。進(jìn)一步分析提示，在水生和陸生植物分

5、化后，譜系特異擴(kuò)增尤其是串聯(lián)重復(fù)是陸生植物OPR基因家族擴(kuò)增與進(jìn)化的主要機(jī)制，并導(dǎo)致多個(gè)OPR亞家族的產(chǎn)生。
　　 ③通過exon-intron結(jié)構(gòu)分析表明，不同譜系物種中的OPR基因內(nèi)含子的數(shù)目和長度呈現(xiàn)多樣性，而內(nèi)含子的位置和相位卻十分保守；這一研究結(jié)果并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析提示，在OPR家族基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化過程中，不同譜系間及同一譜內(nèi)的OPR基因發(fā)生持續(xù)內(nèi)含子丟失，從而導(dǎo)致OPR基因結(jié)構(gòu)的多樣性?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，提出了一個(gè)關(guān)于O

6、PR家族基因結(jié)構(gòu)演化的模型。
　　 ④通過功能分化分析揭示，在進(jìn)化過程中，由于受到局部正選擇作用，不同OPR亞家族及其成員間發(fā)生了功能分化，并且導(dǎo)致功能分化的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)主要分布于OPR蛋白三維結(jié)構(gòu)的外側(cè)，即α螺旋和底物結(jié)合區(qū)。
　　 2)在OsOPR家族基因分子生物學(xué)功能方面：本研究在植物OPR基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析基礎(chǔ)上，選擇分別代表五個(gè)不同OPR亞家族的OsOPR基因即OsOPR04-1(sub.Ⅰ)、OsOPR0

7、8-1(sub.Ⅱ)、OsOPR06-1(sub.Ⅲ)、OsOPR01-1(sub.Ⅳ)和OsOPR02-1(sub.Ⅴ)，采取同源建模、原核表達(dá)、半定量RT-PCR及轉(zhuǎn)基因方法研究水稻不同OPR亞家族基因的蛋白結(jié)構(gòu)、生化及生理功能，取得了以下結(jié)果：
　　 ①通過同源建模及蛋白結(jié)構(gòu)比較分析顯示，盡管不同亞家族OPR蛋白的三維結(jié)構(gòu)的基本骨架高度保守即由8個(gè)α/β交替排列形成桶狀結(jié)構(gòu)，但仍存兩個(gè)在蛋白三維構(gòu)象上呈現(xiàn)明顯差異的MVR

8、i和ii區(qū)；位于MVR i底物結(jié)合區(qū)決定底物與蛋白的特異結(jié)合，而MVR ii則影響底物進(jìn)入由MVR i形成的“口袋”。
　　 ②通過蛋白體外表達(dá)及酶活分析表明，不同亞家族OPR蛋白酶活存在顯著差異且呈現(xiàn)明顯的底物偏好性；除OsOPR02-1外，其他四個(gè)OPR蛋白對反式-2-己烯醛、12-氧-植物二烯酸和順丁烯二酸均呈現(xiàn)出強(qiáng)或中等程度的催化活性，提示這些亞家族OPR基因可能參與十八烷碳烯酸代謝的兩個(gè)主要分支HPL和AOS途徑，以及

9、能量代謝TCA途徑來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育及防御應(yīng)答。
　　 ③通過基因表達(dá)譜分析顯示，OsOPR家族基因的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的組織特異性且不同程度的響應(yīng)多種非生物逆境脅迫誘導(dǎo)。OsOPR04-1(sub.Ⅰ)和OsOPR08-1(sub.Ⅱ)在各種組織及誘導(dǎo)條件下均呈現(xiàn)較強(qiáng)的表達(dá)，提示共存于單、雙子葉植物中的subs.Ⅰ和Ⅱ基因可能在植物生長、發(fā)育及防御中起重要作用；而OsOPR06-1(sub.Ⅲ)、OsOPR01-1(sub.Ⅳ)和