植物與核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)互作分子生物學(xué)的初步研究.pdf

1、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)是世界上破壞性最強的植物病原物之一，引起的菌核病是世界性重要病害，每年造成巨大經(jīng)濟損失，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上迫切需要解決的重要問題。目前對植物與核盤菌互作分子機理的研究還很粗淺。本研究采用生理和蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了核盤菌菌齡影響致病力的機理，組合采用突變體和病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)技術(shù)，分離和鑒定了植物對核盤菌的抗病性調(diào)控基

2、因，獲得了以下主要研究結(jié)果：
　　 1.通過分析核盤菌菌絲培養(yǎng)時間、菌絲體濃度以及接種后的保濕時間等因子對接種后油菜植株發(fā)病的影響，建立了一套有效的基于菌絲懸浮液的核盤菌噴霧接種方法體系。從在平板活化3d后核盤菌菌落邊緣打取菌碟(Ф6mm)，按10塊·100 mL-1加入液體培養(yǎng)基中，25℃、200 r·min-1下振蕩培養(yǎng)4d，用勻漿機勻漿30s制成菌絲懸浮液，終濃度調(diào)至600nm波長下吸光度值為1.0～2.0，用空壓機噴霧接

3、種油菜植株，保濕48h。該接種方法適用于規(guī)?；参锟剐栽u價分析研究。
　　 2.分析了菌齡對核盤菌致病力的影響及其生理生化機理。發(fā)現(xiàn)幼嫩菌絲和老熟菌絲再轉(zhuǎn)接后菌絲生長速度存在顯著差異，幼嫩菌絲的生長活力明顯更高，用于獲取接種用菌絲的轉(zhuǎn)代培養(yǎng)以選取培養(yǎng)2～3d的菌落邊緣的幼嫩菌絲為培養(yǎng)源為宜。不同年齡菌絲的致病力比較分析結(jié)果表明，老熟菌絲的致病力顯著低于幼嫩菌絲。與幼嫩菌絲相比，老熟菌絲接種油菜植株后產(chǎn)生的果膠酶活性以及草酸含量均

4、顯著降低，表明果膠酶活性以及草酸含量的顯著降低是導(dǎo)致老熟菌絲的致病力顯著下降的重要原因。
　　 3.采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較分析了幼嫩菌絲和老熟菌絲的蛋白質(zhì)表達譜。發(fā)現(xiàn)幼嫩菌絲和老熟菌絲蛋白質(zhì)豐度變化在2倍以上的差異表達蛋白點99個。通過MALDI-TOF-TOF-MS質(zhì)譜分析成功鑒定了其中95個。其中約三分之二(59個)在老熟菌絲中表達下調(diào)，三分之一(36個)表達上調(diào)。這些差異表達蛋白主要涉及代謝(43％)、多功能(11％)、細

5、胞骨架和細胞完整性(7％)、氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝(7％)、蛋白降解與裂解(6％)、蛋白合成(5％)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(4％)、抗氧化調(diào)節(jié)(4％)、信號傳導(dǎo)(3％)、誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)(1％)，另外有9％蛋白的功能未知。差異表達蛋白中有12％與草酸合成的調(diào)控相關(guān)，這些差異表達蛋白功能分析揭示了導(dǎo)致老熟菌絲中草酸合成能力下降的兩方面機理。一方面是包括4個草酰乙酸乙基水解酶(Oxaloacetate acetylhydrolase)蛋白，1個異檸檬酸裂解酶

6、(Isocitrate lyase)，以及1個異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate/isopropylmalatedehydrogenase)等在內(nèi)的草酸合成關(guān)鍵正向調(diào)控酶在老熟菌絲中的蛋白含量均顯著下降，另一方面是3個檸檬酸合成酶(Citrate synthase)在老熟菌絲中的蛋白含量則顯著增加，導(dǎo)致合成草酸的直接底物草酰乙酸顯著減少。此外，與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、呼吸、核質(zhì)問轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白在老熟菌絲中的積累量均顯著下降，說明這些活動

7、在老熟菌絲中受到抑制。差異表達蛋白功能分析還表明在老熟菌絲中通過激活多種途徑協(xié)調(diào)保持細胞結(jié)構(gòu)的完整性。這些結(jié)果增進對核盤菌菌絲老熟的生理和致病力變化及其分子機理的理解。
　　 4.組合采用突變體和VIGS技術(shù)，篩選鑒定了一批植物對核盤菌的抗病性調(diào)控基因。采用VIGS技術(shù)分析了13個本氏煙基因?qū)吮P菌的抗性調(diào)控功能，發(fā)現(xiàn) b12(Mitogen-activated protein kinase1)、b16(Small GTP-bi

8、nding protein)和24(Protein disulfide isomerase)沉默后植株的菌核病病害癥狀比對照顯著加重，而b60(Lemir)沉默后的植株病害癥狀則比對照顯著減弱，說明b12、b16和24可能正調(diào)控、而b60可能負調(diào)控本氏煙對核盤菌的抗性。另外，以擬南芥突變體為材料，對WRKY基因家族、MPK和AG01基因的抗病調(diào)控作用進行了分析。與野生型對照相比，接種核盤菌后agol-36、wrky6和wrky31擬南芥