川西高寒森林土壤有機(jī)層c、n、p庫(kù)研究

1、<p>　　玉米秸稈和白菜廢棄物在不同貯存條件下的微生物群落分析</p><p>　　任海偉1, 2, 3 劉菲菲2 李夢(mèng)玉2 李金平1, 3李志忠2** 李東4黃娟娟1, 3孫文斌2 </p><p>　　1蘭州理工大學(xué)西部能源與環(huán)境研究中心 蘭州 730050</p><p>　　2蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 蘭州 730050</p

2、><p>　　3甘肅省生物質(zhì)能與太陽(yáng)能互補(bǔ)供能系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州 730050 </p><p>　　4中國(guó)科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都生物研究所） 成都 610041</p><p>　　摘 要 采用Illumina Miseq高通量技術(shù)分析不同溫度和貯存方式下玉米秸桿（IO）和白菜廢棄物（IA）貯存30 d時(shí)的微生物群落。設(shè)置低溫（O）、中溫（

3、R）和高溫（H）3種溫度。每種溫度條件均設(shè)有秸桿單貯（O）、白菜單貯（A）和二者混貯（X）3個(gè)處理組。結(jié)果表明，IO原料附著細(xì)菌主要有變形菌門（Proteobacteria，65.26%）和厚壁菌門（Firmicutes，33.78%），IA主要包括Proteobacteria（80.23%）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（18.57%）。貯存30d后在屬水平上，IO主要包括腸桿菌（Enterobacter）（47.11%）、

4、肉食桿菌（Carnobacterium）（27.71%）和泛菌（Pantoea）（10.14%）等；IA主要包括假單孢菌（Pseudomonas）（48.40%）、Pantoea（17.10%）和黃桿菌（Flavobacterium）（16.26%）等，IA中幾乎不含乳酸菌，IO中乳酸菌豐度約28.71%。IO組低、高溫單貯時(shí)主要包括Enterobacter（21.76%和35.87%）、Ca</p><p>　

5、　關(guān)鍵詞 高通量測(cè)序；玉米秸稈；白菜廢棄物；貯存條件；微生物群落結(jié)構(gòu)</p><p>　　CLC Q938.1</p><p>　　Microbial Community Analysis of Maize Straw and Cabbage Waste under Different Storage Condition</p><p>　　Ren Haiwei1

6、23, Liu Feifei2, Li Mengyu2, Li Jinping13, Li ZhiZhong2**, Li Dong4, Huang Juanjuan13 & Sun Wenbin2</p><p>　　1 China Western Energy & Environment Research Center, Lanzhou University of Technology, La

7、nzhou 730050, China </p><p>　　2 School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China</p><p>　　3 Key Laboratory of Complementary Energy System of Biomas

8、s and Solar Energy, Lanzhou 730050, China</p><p>　　4 Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology & Environmental Microbiology Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu Institute of Biology

9、, Chinese Academy of Sciences, Chengdu, 610041, China</p><p>　　Abstract The microbial community of maize straw (IO) and cabbage waste (IA) under different storage temperature and storage pattern in 30 days w

10、ere analyzed by Illumina Miseq high-throughput sequencing technologies. Each temperature, such as low temperature (O), medium temperature (R) and high temperature (H) condition were set up with three groups of sole-stora

11、ge of maize straw (O), sole-storage of cabbage waste (A) and mixed storage of IO and IA (X). The results showed that the dominant bacter</p><p>　　Keywords Illumina Miseq; maize straw; cabbage waste; storage

12、 conditions; microbial community.</p><p>　　隨著我國(guó)糧食和蔬菜產(chǎn)量的提高，作物秸稈和尾菜等農(nóng)業(yè)廢棄物資源量逐年增加，這些廢棄物的季節(jié)性“爆炸”產(chǎn)出給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)了嚴(yán)重危害，迫切需要對(duì)其進(jìn)行資源化利用。利用青貯原理將干秸稈與尾菜混合貯存能調(diào)制獲得高品質(zhì)的秸稈動(dòng)物飼料和生物能源原料，從而實(shí)現(xiàn)秸稈和尾菜的資源化處理利用[1-2]。但另一方面，由于一年四季均有蔬菜種植，需要根據(jù)

13、季節(jié)氣候不同來(lái)選擇適宜的尾菜和秸稈處理方式。因此，在不同季節(jié)溫度條件下開(kāi)展干秸稈和尾菜的貯存過(guò)程研究顯得尤為重要，既能解決農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用過(guò)程中的原料供應(yīng)問(wèn)題，又能無(wú)害化消除尾菜污染，一舉多得。</p><p>　　青貯是由多種微生物菌群（乳酸菌等有益菌和霉菌、梭菌等有害菌）共同作用，并依賴于外部因素進(jìn)行自我調(diào)控的復(fù)雜生化過(guò)程。在密閉厭氧環(huán)境中乳酸菌等有益微生物生長(zhǎng)繁殖并逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)，使霉菌等有害微生物的生長(zhǎng)

14、受到抑制，實(shí)現(xiàn)原料的保質(zhì)貯存[3]。貯存溫度及體系中乳酸菌種類、數(shù)量和活性是影響混貯品質(zhì)優(yōu)劣的重要因素，只有加快乳酸菌發(fā)酵，使混貯體系pH迅速降低，才能有效抑制有害菌生長(zhǎng)繁殖[4]。乳酸菌的生長(zhǎng)溫度范圍一般為5 ℃~55 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃~40 ℃，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響其生長(zhǎng)和發(fā)酵品質(zhì)[5-6]。劉秦華等[7]認(rèn)為高溫環(huán)境會(huì)同時(shí)抑制乳酸菌、好氧細(xì)菌和酵母菌繁殖，促進(jìn)乙酸發(fā)酵，同時(shí)由于多數(shù)梭菌屬嗜中溫細(xì)菌，30 ℃時(shí)會(huì)大量繁殖

15、，從而影響發(fā)酵品質(zhì)[8]。低溫貯存（5 ℃~15 ℃）時(shí)則乳酸菌發(fā)酵和pH值下降均比較緩慢，需要較長(zhǎng)時(shí)間才能抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖。Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)牧草飼料的貯存品質(zhì)隨溫度（10 ℃~40 ℃）升高而降低。溫度對(duì)貯存品質(zhì)的影響本質(zhì)上是微生物菌群對(duì)溫度變化的差異化響應(yīng)，探明秸稈和尾菜在不同季節(jié)條件下貯存過(guò)程中的微生物菌群變化很有必要，但尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。</p><p>　　目前，微生態(tài)環(huán)境中微生物菌群多

16、樣性的研究主要包括平板純培養(yǎng)法、變性梯度凝膠電泳（DGGE）和16s rRNA基因末端限制性片段分析技術(shù)（T-RFLP）等分子生物學(xué)方法[10-11]。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法不能反映出樣品中所有菌群的信息，因而只能定性的對(duì)微生物群體進(jìn)行分析[12]。高通量和宏基因組測(cè)序等新技術(shù)為快速尋找適宜人工培養(yǎng)條件、規(guī)避傳統(tǒng)方法的長(zhǎng)周期弊端提供了可能[13]。近年來(lái)，高通量測(cè)序研究微生物多樣性愈發(fā)受到人們關(guān)注，其中Illumina Miseq平臺(tái)已被廣泛用

17、于厭氧發(fā)酵[14] 和腸道[15]等微生物菌群分析，不僅能實(shí)現(xiàn)一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，還能從分類學(xué)的各個(gè)水平上對(duì)菌群的構(gòu)成和豐度進(jìn)行測(cè)定，并且可以鑒定到很多低豐度的菌群。但有關(guān)Illumina Miseq高通量測(cè)序用于青貯發(fā)酵過(guò)程的文獻(xiàn)報(bào)道還很少。Li等[16]通過(guò)Miseq高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)加入微藻會(huì)影響五節(jié)芒青貯過(guò)程中的微生物菌群，五節(jié)芒單獨(dú)青貯3 d時(shí)的優(yōu)勢(shì)菌群為腸球菌屬（Enterococcus），3 d后

18、乳桿菌屬（Lactobacillus）變?yōu)閮?yōu)勢(shì)菌，加入微藻混貯后Lactobacillus</p><p>　　為了研究不同季節(jié)溫度和貯存方式對(duì)秸稈和尾菜貯存過(guò)程中微生物菌群影響，本文參照蘭州地區(qū)不同季節(jié)溫度和氣候條件設(shè)置了低溫（-9 ℃～3 ℃，代表冬季）、17 ℃中溫（代表初春深秋季）和32 ℃高溫（代表夏秋高溫季節(jié)）3種條件，研究了不同溫度下玉米秸稈單獨(dú)貯存、白菜單獨(dú)貯存及二者混合貯存30 d時(shí)的細(xì)菌群落構(gòu)

19、成，探討了溫度和貯存方式對(duì)秸稈和白菜貯存過(guò)程中微生物菌群變化的影響規(guī)律。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　摘穗后的干玉米秸稈（IO）取自蘭州市榆中縣，采集時(shí)間為2015年11月，收集后粉碎至1~2 cm備用；白菜廢棄物（IA）收集自學(xué)校

20、家屬區(qū)菜市場(chǎng)，切成2 cm×2 cm備用。試驗(yàn)時(shí)間為當(dāng)年11月24日～12月23日，該時(shí)間段內(nèi)蘭州市區(qū)的日均最低溫度-9 ℃，最高溫度3 ℃。干玉米秸稈和白菜廢棄物的理化指標(biāo)如表1所示。</p><p>　　表1 干玉米秸稈和白菜廢棄物的理化指標(biāo)（%）</p><p>　　Table 1 Physicochemical indexes of dry maize straw a

21、nd cabbage waste (%)</p><p>　　IA：原料白菜廢棄物；IO：原料干玉米秸稈。DM：干物質(zhì)；WSC：可溶性碳水化合物；CP：粗蛋白；NDF：中性洗滌纖維；ADF：酸性洗滌纖維；ADL：中性洗滌木質(zhì)素。</p><p>　　IA: cabbage waste; IO: dried maize straw. DM: dry matter; WSC: water-so

22、luble carbohydrates; CP: crude protein; NDF: neutral detergent fiber; ADF: acid detergent fiber; ADL: acid detergent lignin.</p><p>　　1.2 貯存試驗(yàn)設(shè)計(jì)</p><p>　　模擬蘭州地區(qū)氣候條件，設(shè)置了3種溫度梯度，分別為低溫（-9 ℃～3 ℃，冬季，代

23、號(hào)O）、中溫17 ℃（初春深秋季節(jié)平均溫度，代號(hào)R）和高溫32 ℃（夏秋高溫季節(jié)平均溫度，代號(hào)H）。每種溫度條件均設(shè)有白菜單貯組（代號(hào)A）、秸稈單貯組（代號(hào)O）和秸稈/白菜混貯組（代號(hào)X）3個(gè)對(duì)照組。9個(gè)處理組分別命名為OA（低溫白菜單貯組）、OO（低溫干秸稈單貯組）、OX（低溫混貯組）、RA（中溫白菜單貯組）、RO（中溫干秸稈單貯組）、RX（中溫混貯組）、HA（高溫白菜單貯組）、HO（高溫干秸稈單貯組）和HX（高溫混貯組）。其中，秸稈

24、單貯組為3 kg IO，白菜單貯組為3 kg IA，混貯組為0.79 kg IO和2.21 kg IA的混合物，混貯組中初始水分含量為73.01%。每個(gè)處理組均設(shè)置三個(gè)平行，軟體發(fā)酵裝置中厭氧密閉貯存30 d。</p><p>　　1.3 貯存料的DNA提取</p><p>　　無(wú)菌環(huán)境下準(zhǔn)確稱取60 g貯存樣品，分成三份后分別加入200 mL無(wú)菌生理鹽水，37 ℃恒溫振蕩2 h后提取細(xì)

25、菌基因組DNA，方法參照Water DNA Isolation Kit說(shuō)明書。</p><p>　　1.4 PCR 擴(kuò)增</p><p>　　以上述微生物基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S rDNA V4-V5區(qū)，選擇的引物為帶有barcode的515F(5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3)和907R(5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3)。采用PCR儀

26、（ABI GeneAmp® 9700型）對(duì)細(xì)菌16s rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物[18]。</p><p><b>　　1.5 熒光定量</b></p><p>　　參照1.4中瓊脂糖凝膠電泳初步定量結(jié)果，將

27、PCR產(chǎn)物用QuantiFluor? -ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量[18]。</p><p>　　1.6 Illumina 文庫(kù)構(gòu)建 </p><p>　　Illumina文庫(kù)構(gòu)建：連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集，利用氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段[19]。</p><p>

28、;　　1.7 Illumina 平臺(tái)測(cè)序</p><p>　　DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；另一端隨機(jī)與附近另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定，形成“橋”；PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈；加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3&

29、#39;端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸；統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列[19]。</p><p>　　1.8 生物信息學(xué)分析</p><p>　　使用CLUSTALW軟件分析，序列相似性大于97%時(shí)定義為相同的操作分類單元（operational taxonomic units, OTUs）。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為使信息分析結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，首先

30、對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，得到優(yōu)化序列[17]。然后在去除嵌合體序列后進(jìn)行OTU聚類分析，對(duì)OTU的代表序列做分類學(xué)分析?；贠TU聚類分析結(jié)果，可對(duì)OTU進(jìn)行豐度、Alpha多樣性及物種在各分類水平上的群落結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，得到細(xì)菌群落組成；基于分類學(xué)信息，在各個(gè)分類學(xué)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析；基于系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行unifrac等分析[20]。</p><p><b>　　2 結(jié)果與分析</b>

31、;</p><p>　　2.1 OTU分布統(tǒng)計(jì)</p><p>　　OTU是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一分類單元（品系、屬、種、分組等）設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志。通過(guò)歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個(gè)小組就是一個(gè)OTU[21]。利用Usearch軟件對(duì)優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列，去除沒(méi)有重復(fù)的單序列，按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類，在聚類過(guò)

32、程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列[20]。 </p><p>　　由表2可知，RX1組和HX1組的OTU數(shù)量明顯高于相同溫度時(shí)的秸稈單貯組（RO1和HO1）和白菜單貯組（RA1和HA1）中OTU數(shù)量，且高于IO和IA本底OTU數(shù)量；相反，OX1的OTU數(shù)量明顯低于OA1和OO1組OTU數(shù)量，也遠(yuǎn)低于原料本底OTU數(shù)量。另一方面，中、高溫條件IO和IA混合貯存時(shí)的OTU數(shù)量較高，IA低、中溫單獨(dú)貯存時(shí)的OTU數(shù)

33、量較高，IO低溫單獨(dú)貯存時(shí)的OTU數(shù)量高于RO1和HO1；而且低溫和高溫時(shí)IO單貯組OTU數(shù)量均高于IA單貯組OTU數(shù)量?？梢?jiàn)，原料種類、貯存溫度和方式對(duì)細(xì)菌群落多樣性有很大影響。</p><p>　　表2 原料和不同處理組的OTU數(shù)</p><p>　　Table 2 OTU in the raw material and different treatment groups<

34、/p><p>　　OA1：低溫單貯IA；OO1：低溫單貯IO；OX1：低溫IO和IA混貯；RA1：中溫單貯IA；RO1：中溫單貯IO；RX1：中溫IO和IA混貯；HA1：高溫單貯IA；HO1：高溫單貯IO；HX1：高溫IO和IA混貯。下同。</p><p>　　OA1: IA stored at low temperature; OO1: IO stored at low temperatur

35、e; OX1: IO stored with IA at low temperature; RA1: IA stored at medium temperature; RO1: IO stored at medium temperature; RX1: IO stored with IA at medium temperature; HA1: IA stored at high temperature; HO1: IO stored a

36、t high temperature; HX1: IO stored with cabbage waste at high temperature. The same below. </p><p>　　2.2 Venn圖</p><p>　　根據(jù)處理組貯存前后OTU的相似性和差異性得到圖1所示的維恩圖，如圖所示，IA、OA1、RA1和HA1中共有的OTU為35個(gè)，IO、OO1、RO1

37、和HO1中共有的OTU數(shù)為59個(gè)，OX1、RX1和HX1中共有的OTU數(shù)位68個(gè)。不同溫度下貯存樣品的物種多樣性存在明顯差異，且3種溫度時(shí)的混貯組樣品OTU共有數(shù)量最多，它們之間的微生物群落相似性最高。</p><p>　　圖1 原料和不同處理組的OTU維恩圖</p><p>　　Fig. 1 Venn diagram of operational taxnonmic unit in

38、the raw material and different treatment groups </p><p>　　2.3 物種豐度分析</p><p>　　2.3.1 稀釋性曲線</p><p>　　從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體，統(tǒng)計(jì)這些個(gè)體所代表的物種數(shù)目，并以個(gè)體數(shù)與物種數(shù)來(lái)構(gòu)建曲線，這種曲線叫做稀釋性曲線。它可以用來(lái)比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度

39、，也可以用來(lái)說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理[22]。如圖2，橫坐標(biāo)代表樣本量，縱坐標(biāo)代表抽樣后OTU的數(shù)目。隨著樣本量的加大，曲線越來(lái)越平緩，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU[23]。在相同序列數(shù)時(shí)，RX1和OX1的OTU數(shù)量較高，說(shuō)明中、低溫混貯時(shí)的微生物群落多樣性較高。</p><p>　　圖2 原料和不同處理組的稀釋性曲線</p><p>　　Fig. 2 R

40、arefaction in the raw material and different treatment groups</p><p>　　2.3.2 Rank-Abundance曲線</p><p>　　樣品的物種豐度和物種均勻度可以用Rank-Abundance曲線可以用來(lái)解釋。物種的豐度由曲線的寬度來(lái)反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀反映了樣本中物種的均度，

41、曲線越平緩，物種分布越均勻[24]。由圖3可知，RX1在橫軸上范圍最廣，其次是OX1，說(shuō)明RX1和OX1的物種豐度較高。隨著OTU等級(jí)數(shù)的增加，所有曲線均變得較為平緩，說(shuō)明各組中的物種分布比較均勻。</p><p>　　圖3 原料和不同處理組的Rank-Abundance曲線</p><p>　　Fig. 3 Rank-Abundance curve in the raw materi

42、al and different treatment groups</p><p>　　2.4 Alpha多樣性分析</p><p>　　Alpha多樣性分析是指對(duì)一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性分析，其反應(yīng)了兩個(gè)綜合指標(biāo)，即群落豐富度指數(shù)，包括Chao指數(shù)和Ace指數(shù)；群落多樣性指數(shù)包括Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)[21]。其中Chao指數(shù)或Ace指數(shù)越大，意味著群落豐富度越高

43、；Shannon指數(shù)越大，意味著群落多樣性越高[25]；Simpson指數(shù)越大，意味著群落多樣性越低。由表3可以看出，混貯組的ace指數(shù)和chao指數(shù)均高于IO單貯組，說(shuō)明其群落豐富度較高，且RX1組中指數(shù)最大，群落豐富度最高。RX1和OX1的shannon指數(shù)也較大，表明它們的群落多樣性也較高。所有處理組的coverage數(shù)值都較大，說(shuō)明本次測(cè)序的結(jié)果可以代表樣本中微生物群落的真實(shí)情況。</p><p>　　表

44、3 原料和不同處理組的Alpha多樣性指數(shù)</p><p>　　Table 3 Alpha diversity in the raw material and different treatment groups </p><p>　　Chao：是用chao算法估計(jì)樣品中所含OTU數(shù)目的指數(shù)。Ace：用來(lái)估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)。Simpson：用來(lái)估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一。

45、Shannon：用來(lái)估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一。Coverage：反映本次測(cè)序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。</p><p>　　Chao: It is used to estimate the number of OTUs contained in the sample using the Chao algorithm. Ace: It is used to estimate the number

46、of OTUs in a community. Simpson: It is used to estimate one of the microbial diversity indices in the sample. Shannon: It is used to estimate one of the microbial diversity indices in the sample. Coverage: It reflects wh

47、ether the results of this sequencing represent the real situation of microbes in the sample.</p><p>　　2.5 溫度和貯存方式對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響</p><p>　　2.5.1各處理組的門分類群落組成</p><p>　　由圖4可知，原料IA中的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌

48、門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），豐度分別為80.23% 和18.57%；低溫貯存后優(yōu)勢(shì)菌門為Proteobacteria和厚壁菌門（Firmicutes），與原料相比Proteobacteria豐度降低而Firmicutes豐度上升；中溫貯存后Firmicutes的豐度上升為87.27%，Proteobacteria的豐度下降為12.07%；高溫時(shí)Firmicutes的菌群豐度為82.39%。

49、原料IO中Proteobacteria門豐度最高達(dá)65.26%，而Firmicutes豐度較低，僅有33.78%，低溫單貯后Firmicutes豐度增加至44.23%，中、高溫貯存時(shí)Firmicutes豐度降至8.14%和29.38%。原料IA和IO高溫混合貯存30 d時(shí)Proteobacteria豐度最高（85.16%），F(xiàn)irmicutes豐度最低（13.74%）；低、中溫混貯時(shí)Firmicutes為優(yōu)勢(shì)菌門，還有少量Proteob

50、acteria、放線菌門（Actinobacteria）和Bacteroidet</p><p>　　圖4 原料和不同處理組的門水平分類細(xì)菌群落</p><p>　　Fig. 4 The community composition in the raw material and different treatment groups at the level of Phylum</

51、p><p>　　2.5.2各處理組的屬水平群落組成</p><p>　　各處理組中屬水平群落組成如圖5所示，由圖可知，原料IO附著的細(xì)菌群落包括腸桿菌屬（Enterobacter）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、泛菌屬（Pantoea）和假單孢菌屬（Pseudomonas）等，其中Enterobacter豐度最高為47.11%；原料IA附著的細(xì)菌群落包括Pseudomonas、P

52、antoea、黃桿菌屬（Flavobacterium）和Enterobacter等，其中優(yōu)勢(shì)菌群Pseudomonas豐度最高為48.40%。</p><p>　　IA低溫單獨(dú)貯存時(shí)細(xì)菌種群最為豐富，乳桿菌屬（Lactobacillus）豐度為28.43%，耶爾森氏鼠疫桿菌（Yersnia）和Enterobacter豐度次之，分別為19.50%和17.13%，還含有少量明串珠菌屬（Leuconostoc）（11.

53、02%）、Pantoea（8.62%）和乳球菌屬（Lactococcus）（5.73%）等。中、高溫單貯時(shí)乳桿菌屬（Lactobacillus）均為優(yōu)勢(shì)菌，豐度分別高達(dá)80.07%和74.63%。RA1中Enterobacter相對(duì)豐度為8.62%，明串珠菌屬（Leuconostoc）相對(duì)豐度為6.19%，Pantoea、Pseudomonas和Flavobacterium等細(xì)菌豐度均低于1%，HA1中Enterobacter、Leuc

54、onostoc和Yersnia豐度分別為11.24%、5.98%和4.37%。綜合分析，IA低溫單貯時(shí)乳酸菌屬豐度之和僅為48.93%，Enterobacter和Yersnia等腐敗菌豐度較高，低溫貯存可能導(dǎo)致Enterobacter等有害微生物大量繁殖，影響發(fā)酵品質(zhì)[18]；中、高溫單貯時(shí)Lactobac</p><p>　　IO單獨(dú)貯存后，中溫RO1組中的Enterobacter豐度升至66.72%，Carn

55、obacterium豐度降至1.69%，Pantoea和Pseudomonas豐度變化不大；低、高溫貯存時(shí)Enterobacter和Carnobacterium仍為優(yōu)勢(shì)菌屬，Pseudomonas豐度也分別升至18.00%和26.99%，Pantoea豐度分別降至4.66%和3.92%?？梢?jiàn)干秸稈單貯時(shí)無(wú)論溫度高低腐敗菌均占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)。二者混貯后，高溫HX1組中Enterobacter豐度高達(dá)70.57%，Carnobacterium等乳

56、酸菌豐度僅有4.90%，Pantoea和Pseudomonas的相對(duì)豐度分別為5.43%和6.16%；低、中溫時(shí)腐敗菌Enterobacter豐度明顯下降，乳酸菌屬豐度分別高達(dá)82.21%和77.80%，其中Lactobacillus仍為優(yōu)勢(shì)菌屬，豐度分別為52.03%和53.53%，Leuconostoc的豐度分別為13.07%和5.94%?？梢?jiàn)，中、低溫IO/IA混合貯存有利于乳酸菌生長(zhǎng)繁殖進(jìn)而變?yōu)閮?yōu)勢(shì)菌群，有效抑制Enteroba

57、cter等腐敗菌，而高溫環(huán)境貯存時(shí)</p><p>　　圖5 原料和不同處理組的屬水平分類細(xì)菌群落</p><p>　　Fig. 5 The community composition in the raw material and different treatment groups at the level of Genus</p><p>　　2.5.3

58、屬水平各處理組的乳酸菌多樣性</p><p>　　由圖6可知，原料IA中主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus），肉食桿菌屬（Carrobacterium），明串珠菌屬（Leuconostoc），腸球菌屬（Enterococcus），乳球菌屬（Lactococcus）和鏈球菌屬（Streptococcaceae）等乳酸菌。IA單獨(dú)貯存后，低、中、高溫時(shí)各處理組中Lactobacillus占乳酸菌比重均較原料

59、有所提高，且中溫時(shí)比重最高為40%；Carrobacterium和Enterococcus所占比重有所減少，低溫時(shí)僅有4.35%；Lactococcus和Streptococcaceae比重也有所降低，中、高溫時(shí)僅有10%；Leuconostoc、片球菌屬（Pediococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）所占比重均有不同程度的提高。</p><p>　　原料IO主要包括Carrobacterium、Ma

60、rinilactibacillus、Enterococcus、Vagococcus、德瑟茲氏菌屬（Desemzia）和乳球菌屬（Lactococcus）。IO原料中未發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬（Lactobacillus），但貯存后Lactobacillus比重顯著增加，低溫時(shí)比重約占41.68%，中、高溫時(shí)Lactobacillus比重分別為37.50%和30.76%；另一方面，原料IO中Carrobacterium比重較高（37.51%），但貯存

61、后比重有所下降，低、中、高溫時(shí)分別下降為25.01%、12.50%和23.07%； IO中Enterococcus和Vagococcus比重均為12.50%且不含有Leuconostoc，低、高溫時(shí)Enterococcus和Vagococcus比重分別降至8.34%和7.69%，Leuconostoc比重分別增至8.34%和15.38%；并且三種溫度下貯存后均未發(fā)現(xiàn)Lactococcus。</p><p>　　混

62、貯組中，低溫時(shí)Lactobacillus所占比重最大為30%，高溫時(shí)Carrobacterium和Lactobacillus所占比重最大，均為25.01%，Desemzia、Marinilactibacillus、Enterococcus和Lactococcus的比重均為12.5%。中溫時(shí)Lactobacillus比重最大為25%，Leuconostoc比重為16.67%，Carrobacterium比重為12.50%，Weissell

63、a和Leuconostoc比重為8.33%，其余乳酸菌數(shù)均在5%以下。 </p><p>　　總之，原料IA中Lactobacillus比重較高，且在3種溫度貯存后不同處理組種Lactobacillus比重均有所增加。原料IO中不含Lactobacillus，但在3種溫度貯存后Lactobacillus所占比重均在30%以上。混貯組Lactobacillus比重均在25%以上。原料IA、IO及所有處理組均含有C

64、arrobacterium和Enterococcus。IO及其單貯組中不含Pediococcus、Weissella和Streptococcaceae，混貯低、中溫組Pediococcus比重分別為5%和4.17%，Weissella比重分別為10%和8.33%；中溫組Streptococcaceae比重為4.17%。</p><p>　　圖6 原料和不同處理組的乳酸菌多樣性分析</p><

65、p>　　Fig. 6 Composition of Lactic Acid Bacteria in the raw material and different treatment groups at the level of Genus</p><p>　　2.5.4 基于PCA的群落結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　為進(jìn)一步分析樣品間的差別，對(duì)每一個(gè)樣品的OTU信息構(gòu)建了未加權(quán)的U

66、nfirac歐氏距離矩陣（unweighted Unifrac distanc matrix），基于這一矩陣進(jìn)行了主坐標(biāo)分析，即PCA分析。它是基于每個(gè)樣品中所含有的全部OTU完成的，以百分?jǐn)?shù)的形式體現(xiàn)主成分的主要影響程度[26]。樣本間的組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。通過(guò)在PCA圖中的樣本間的分散和聚集分布反映樣本間細(xì)菌群落的相似程度[27]。</p><p>　　如圖7所示，每個(gè)點(diǎn)代表了一個(gè)處理組，

67、主成分分析共提取了三個(gè)主成分，其中第一主成分PC1和第二主成分PC2貢獻(xiàn)率分別為48.8%和21.24%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了70.04%，可以解釋變量的絕大部分信息。OO1組與HO1組距離較近，RA1組與HA1組距離較近，RX1組與OX1組的距離較近，說(shuō)明它們兩兩之間的相似性較高。并且IA組與IO組和其余樣品的距離都比較遠(yuǎn)，說(shuō)明貯存前后樣品的微生物群落有較明顯的變化。由此可見(jiàn)，貯存原料的種類和溫度是影響微生物群落組成的主要影響因素。<

68、;/p><p>　　圖7 原料和不同處理組的PCR分析</p><p>　　Fig.7 Principal Component Analysis in the raw material and different treatment groups</p><p>　　2.6 基于Unifrac的聚類的比較分析</p><p>　　2.6.1

69、多樣本相似度樹(shù)狀圖</p><p>　　利用樹(shù)枝結(jié)構(gòu)描述和比較多個(gè)樣本間的相似性和差異關(guān)系。首先使用描述群落組成關(guān)系和結(jié)構(gòu)的算法計(jì)算樣本間的距離，即根據(jù)beta多樣性距離矩陣進(jìn)行層次聚類（Hierarchical cluatering）分析，使用非加權(quán)組平均法UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）算法構(gòu)建樹(shù)狀結(jié)構(gòu)，得到樹(shù)狀關(guān)系形式用于可視化

70、分析[28]。</p><p>　　通過(guò)braycurtis算法使用Qiime計(jì)算beta多樣性距離矩陣，算法如下：</p><p>　　SA,i = 表示A樣本中第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)；</p><p>　　SB,i = 表示B樣本中第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)[27]。</p><p>　　由圖8可以看出，11個(gè)處理組可以分為兩大

71、類，其中IO、RO1、HO1、OO1與HX1聚為一大類，且IO、OO1與HO1在同一分支上，HX1與RO1在同一分支上，說(shuō)明它們的細(xì)菌群落組成相似性較高；IA單獨(dú)為一個(gè)分支，說(shuō)明它與其余試驗(yàn)組的群落組成差異性較大；RX1、OX1、RA1、OA1與HA1均在第二分支上，說(shuō)明其趨同性較高，；OX1與RX1在同一分支，它們的群落組成相似性最高。這與上述PCA分析得到的結(jié)果是一致的。</p><p>　　圖8 原料和不

72、同處理組的多樣本相似度樹(shù)狀圖</p><p>　　Fig. 8 Multi-sample similarity tree in the raw material and different treatment groups</p><p>　　2.6.2 Heatmap熱圖分析</p><p>　　將數(shù)據(jù)進(jìn)行物種或樣本間豐度相似性聚類，將聚類后數(shù)據(jù)表示在heatm

73、ap圖上，可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過(guò)顏色梯度及相似程度反映多個(gè)樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性[29]。如圖9所示，RA1與HA1，RX1與OX1，HO1與OO1的相似性較高，而IA與RA1、HA1、OA1以及IO與RO1、HO1、OO1的差異性較大，說(shuō)明IA和IO經(jīng)不同溫度或方式進(jìn)行貯存后微生物群落組成發(fā)生了很大變化。</p><p>　　圖9 原料和不同處理組的多樣性熱圖</p&

74、gt;<p>　　Fig. 9 Diversity heatmap in the raw material and different treatment groups </p><p><b>　　3 討論與結(jié)論</b></p><p>　　生物質(zhì)原料貯存過(guò)程中的細(xì)菌群落變化一定程度上能反映貯存品質(zhì)變化的本質(zhì)原因，尤其乳酸菌是貯存過(guò)程中發(fā)揮主要作用

75、的菌群，其數(shù)量及種類變化與貯存品質(zhì)之間有著密切聯(lián)系。本文基于Miseq Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)分析了溫度和貯存方式對(duì)IO和IA貯存過(guò)程中微生物菌群的影響。OTU聚類顯示，不同溫度下混貯組中的OTU數(shù)量高于單貯組，且室溫混貯RX1組的OTU最大，但高溫時(shí)OTU數(shù)量有所下降，說(shuō)明溫度過(guò)高會(huì)降低混貯存過(guò)程中的微生物多樣性。因?yàn)闇囟壬呤谷樗峋扔幸婢钚詼p弱，且易導(dǎo)致丁酸發(fā)酵，使處理組中的微生物群落豐富度降低[30]。物種豐度分析和A

76、lpha多樣性分析表明，混貯組（RX1、HX1,、OX1）的群落豐富度均比單貯組高，且RX1的微生物群落最為豐富。</p><p>　　細(xì)菌群落分析表明，IA中優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），不同溫度下IA單獨(dú)貯存后Proteobacteria豐度均有降低，而厚壁菌門（Firmicutes）的豐度均有升高，且中、高溫貯存時(shí)Firmicutes豐度分別升高

77、至87.27%和82.39%。原料IO中優(yōu)勢(shì)菌門為Proteobacteria和Firmicutes，低溫貯存后Firmicutes豐度下降，中、高溫貯存時(shí)Firmicutes豐度上升。二者高溫混貯時(shí)的Proteobacteria的豐度最高（85.16%），而Firmicutes的豐度最低（13.74%），中、低溫混貯時(shí)Firmicutes的豐度最高分別為82.74%和78.64%。Firmicutes是革蘭氏陽(yáng)性菌，主要為產(chǎn)芽孢、非產(chǎn)

78、芽孢和支原體群體，能降解多種大分子化合物，可能會(huì)引起貯存料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量變化。Proteobacteria包括大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌，它們會(huì)與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)性利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生生物胺，從而影響青貯發(fā)酵品質(zhì)。</p><p>　　原料IO附著的細(xì)菌群落包括腸桿菌屬（Enterobacter）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、泛菌屬（Pantoea）和假單孢菌屬（Pseudomonas）等，其中Ente

79、robacter豐度最高為47.11%；原料IA附著的細(xì)菌群落包括Pseudomonas、Pantoea、黃桿菌屬（Flavobacterium）和Enterobacter等，其中優(yōu)勢(shì)菌群Pseudomonas豐度最高為48.40%。二者混合貯存能為乳酸菌生長(zhǎng)繁殖提供必要條件，原料所附著乳酸菌能迅速繁殖產(chǎn)生乳酸降低環(huán)境pH，抑制腐敗菌生長(zhǎng)[31]。低溫IA單貯時(shí)乳酸菌屬豐度之和僅為48.93%，Enterobacter和Yersnia等

80、腐敗菌豐度較高，低溫貯存可能導(dǎo)致Enterobacter等有害微生物大量繁殖，影響發(fā)酵品質(zhì)。中、高溫單貯時(shí)Lactobacillus為優(yōu)勢(shì)菌，乳酸菌屬的豐度之和分別高達(dá)87.14%和82.29%，腐敗菌被有效抑制，對(duì)白菜青貯發(fā)酵有積極作用。干秸稈單貯時(shí)無(wú)論溫度高低，腐敗菌均占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而影響貯存品質(zhì)。二者混貯后，高溫HX1組中Enterobacter豐度高達(dá)70.57%</p><p>　　從乳酸菌多樣性角度來(lái)

81、看，原料IA中Lactobacillus比重較高，且在3種溫度貯存后不同處理組中Lactobacillus比重均有所增加。原料IO中不含Lactobacillus，但在3種溫度貯存后Lactobacillus所占比重均在30%以上?；熨A組Lactobacillus比重均在25%以上。劉晶晶等[34]發(fā)現(xiàn)青貯發(fā)酵時(shí)Lactobacillus為優(yōu)勢(shì)菌群，這與本研究結(jié)果一致。原料經(jīng)不同溫度貯存后Carrobacterium豐度均有所下降，中、

82、低溫時(shí)Lactobacillus比重均有上升，且室溫時(shí)比重高達(dá)40%，高溫時(shí)Lactobacillus豐度有所下降。IO主要包括Carrobacterium、Desemzia、Marinilactibacillus、Enterococcus、漫游球菌屬（Vagococcus）和Lactococcus。低溫單貯后新出現(xiàn)Lactobacillus，比重高達(dá)41.68%。IA/IO低溫混貯時(shí)Lactobacillus比重最高（30.00%），

83、高溫時(shí)Carrobacterium比重最高為25.01%，中、低溫時(shí)分別為12.50%和15%。IO</p><p>　　總之，白菜單獨(dú)貯存宜選擇中溫或高溫條件，低溫貯存時(shí)乳酸菌豐度較低，易發(fā)生腐敗變質(zhì)；干秸稈單一貯存時(shí)無(wú)論溫度高低，均含有大量的腐敗細(xì)菌，故不宜直接單貯；秸稈/白菜適宜在低、中溫條件混合貯存，該溫度區(qū)間時(shí)乳酸菌占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)。貯存過(guò)程中微生物菌群的變化會(huì)引起感官品質(zhì)、化學(xué)組分和發(fā)酵品質(zhì)等方面的變化，因

84、此還需要進(jìn)一步深入探索不同原料的適宜貯存方式和溫度條件，并對(duì)貯存料的微生物菌群進(jìn)行正向調(diào)控，從而為秸稈、白菜廢棄物的飼料化或能源化利用奠定理論基礎(chǔ)。</p><p>　　參考文獻(xiàn) [References]</p><p>　　楊道蘭, 汪建旭, 馮煒弘. 花椰菜莖葉與玉米秸稈的混貯品質(zhì)[J]. 草業(yè)科學(xué), 2014, 31 (3):551-557 [Yang DL, Wang JX, Fe

85、ng WH. Effects of broccoli stems and leaves and maize straw mix-ensiling on silage quality[J]. Practaculture Science, 2014, 31 (3): 551-557]</p><p>　　任海偉, 王聰,竇俊偉,李志忠,李金平,孫永明. 玉米秸稈與白菜的混合青貯品質(zhì)及產(chǎn)沼氣能力分析[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)

86、報(bào), 2016, 32 (12):187-194[Ren HW, Wang C, Dou JW, Li ZZ, Li JP, Sun YM. Mixed ensiling quality of maize straw with waste cabbage and biogas production potential analysis[J]. Journal of Agricultural Engineering, 2016, 32 (

87、12):187-194]</p><p>　　Piotr OP, Anne BT, Jens ES. Ensiling: Wet-storage method for lignocellulosic biomass for bioethanol production[J]. Biomass and Bioenergy, 2011, 35 (5): 2087-2092.</p><p>　　

88、Zheng Y, Yu CW, Cheng YS, Zhang RH, Jenkins B. Effects of ensilage on storage and enzymatic degradability of sugar beet pulp[J]. Bioresource Technology, 2011, 102 (2):1489-95.</p><p>　　Liu QH, Shao T, B

89、ai YF. The effect of fibrolytic enzyme, Lactobacillus plantarum and two food antioxidants on the fermentation quality, alpha-tocopherol and beta-carotene of high moisture napier grass silage ensiled at different temperat

90、ures[J]. Animal Feed Science and Technology, 2016,221(12), 221:1-11.</p><p>　　Zhang J G, Kumai S, Fukumi R. Effects of temperature, moisture and cellulases on the fermentation quality and chemical compositio

91、n of naked barley (hordeum vulgare l. emand lam) straw silage[J]. Journal of Japanese Society of Grassland Science, 1997, 43(2):88-94.</p><p>　　劉秦華, 李湘玉, 丁良, 吳琳, 張建國(guó), 邵濤. 溫度和添加劑對(duì)象草青貯發(fā)酵品質(zhì)α-生育酚和β-胡蘿卜素的影響[J]. 草

92、業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24 (7):1317-1322 [Liu QH, Li XY, Ding L, Wu L, Zhang JG, Shao T. Effect of temperature and additives on fermentation and alpha-tocophero and beta-carotene content of Pennisetum purpureum silage[J]. Acta Pratac

93、ulturae Sinica, 2015, 24 (7):1317-1322]</p><p>　　Wang C, Nishino N. Effect of storage temperature and ensiling period on fermentation products, aerobic stability and microbial communities of total mixed rati

94、on silage[J]. Journal of Applied Microbiology, 2013, 114 (6):1687-1695.</p><p>　　Zhang JG, Kumai, Ryohei F. Effect of lactic acid bacteria and cellulose additives at different temperatures on the fermentatio

95、n quality of corn and Guineagrass Silages[J]. Acta Prataculturae Sinica, 1997, 6 (3):66-75.</p><p>　　Yang YH, Wang XF, Liu BJ, Gao LJ, Ishii M, Igarashi Y, Cui JZ. Effects of water-soluble carbohydrate conte

96、nt on silage fermentation of wheat straw[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering, 2006, 101(3):232-237.</p><p>　　余素林, 吳曉磊, 錢易. 環(huán)境微生物群落分析的T-RFLP技術(shù)及其優(yōu)化措施[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2006, 12(6):861-868[Yu SL, Wu XL,

97、 Qian Y. Application and optimization of T-RFLP method for microbial community analysis[J]. Chin J Appl Environ Biol, 2006, 12(6):861-868]</p><p>　　范念斯, 齊嶸, 楊敏. 未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)方法進(jìn)展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2016,22 (3):524-5

98、30 [Fan NS, Q R, Y M. Current technical progresses in the cultivation for uncultured microorganism[J]. Chin J Appl Environ Biol, 2016,22 (3):524-530]</p><p>　　許穎, 馬德勝, 宋文楓. 16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)分析油藏微生物多樣性[J]. 應(yīng)用與環(huán)

99、境生物學(xué)報(bào), 2016, 22 (3):409-414 [Xu Y, Ma DS, Song WF. 16S rDNA-assisted high-throughput sequencing analysis of microbial diversity in oil reservoirs[J]. Chin J Appl Environ Biol, 2016, 22 (3):409-414]</p><p>　　

100、芮俊鵬, 李吉進(jìn), 李家寶. 豬糞原料沼氣工程系統(tǒng)中的原核微生物群落結(jié)構(gòu)[J]. 化工學(xué)報(bào), 2014, 65 (5):1868-1875 [Rui JP, Li JJ, Li JB. Prokaryotic community structures in biogas plants with swine manure[J]. Journal of Chemical Industry, 2014, 65 (5):1868-1875]&