植物保護學科前沿論文

1、<p><b>　　中國農業(yè)大學</b></p><p><b>　　課程論文</b></p><p>　　論文題目： 分子生物學技術在昆蟲分類中的應用</p><p>　　課程名稱：植物保護學科前沿 </p><p>　　任課教師： 彭友良 &l

2、t;/p><p>　　班　　級： 植物保護11班 </p><p>　　學　　號： SY13010062 </p><p>　　姓　　名： 衛(wèi)玉鋒 </p><p>　　分子生物學技術在昆蟲分類中的應用</p><p>　　摘要：隨著科學技術的發(fā)

3、展,生物技術已越來越多地被應用在昆蟲分類學研究中。本文概述了核酸序列分析、RAPD、RFLP、分子雜交、SSCP及DSCP等生物技術在昆蟲分類研究中的應用情況,并展望了分子生物學技術在昆蟲分類研究中的前景。</p><p>　　關鍵詞:分子生物學技術;昆蟲分類</p><p>　　目前,已經定名的昆蟲有100多萬種,占已知動物的2 /3,但是全世界仍約有90%的昆蟲是未知種[ 1 ]。隨著

4、科學技術的進步以及各個學科的交叉滲透,已有200多年歷史的昆蟲分類學也獲得了極大的發(fā)展,特別是現代生物技術的應用更加速了昆蟲分類學發(fā)展的步伐。長期以來,昆蟲分類主要是以外部形態(tài)特征為依據。因為外部形態(tài)特征較為直觀,且容易掌握,而根據昆蟲的形態(tài)特征作為分類依據在目等分類單元中可以很好的反映物種的分類地位。但是,在小的分類單元,如屬、族、種內則不容易確定物種的分類地位,再到種群、生態(tài)型則更難確定分類地位。20世紀70年代以來,先后出現了核酸

5、序列分析、隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD) 、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP) 、分子雜交技術、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)及雙鏈構象多態(tài)性(DSCP)技術等多種現代分子生物學技術,極大的促進了昆蟲分類學的發(fā)展。</p><p><b>　　1 研究及應用現狀</b></p><p>　　核酸序列(線粒體DNA和核糖體DNA)分析技術</p><p

6、>　　線粒體DNA為雙鏈閉環(huán)分子。昆蟲的線粒體DNA大小為1514～1613 kb,其中含有編碼2個核糖體RNA (12S rRNA, 16S rRNA) 、22個t RNA、1個細胞色素b、3個細胞色素氧化酶(CO I、CO II、COIII) 、6個NADH降解酶(ND 1～6)和2個ATP酶(6和8)的基因[ 2 ] 。目前,通常用于昆蟲分類研究的基因有以下幾種: 16S rRNA、細胞色素b、ND2、COI、CO II等。

7、</p><p>　　潘興麗等以線粒體細胞色素b (Cyt b)基因作為分子標記,首次對緣蝽科4亞科14種昆蟲進行序列測定,獲得Cyt b基因412 bp 的序列片段。以篩豆龜蝽為外群構建系統(tǒng)發(fā)育樹,表明在亞科級關系上,姬緣蝽亞科最原始,蛛緣蝽亞科次之,巨緣蝽亞科和緣蝽亞科親緣關系較近[3] 。姚銀花等通過對我國大螟S esam ia inferens 9 個地理種群的線粒體DNA CO II基因的測序,并分析了

8、大螟不同地理種群之間的CO II序列的遺傳分歧及相似性,同時建立其系統(tǒng)發(fā)育關系[4] 。</p><p>　　核糖體DNA是編碼核糖體RNA的基因,是一類中度重復的DNA序列,以串聯多拷貝形式存在于染色體DNA 中。每個重復單位由非轉錄間隔區(qū) (NTS) 、轉錄間隔區(qū)( ITS)和3 種RNA ( 18S、518S、28S RNA)基因編碼區(qū)組成[ 5 ] 。由于rDNA是生物界普遍存在的遺傳結構,具有多拷貝性、

9、編碼區(qū)保守、轉錄間隔區(qū)中度保守等優(yōu)點,因而在個體及群體內有較好的均一性,少量樣品能有效代表其來源群體的rDNA的變異情況。因此, rDNA已成為生物系統(tǒng)進化研究中一個非常有用的分子標記[6] 。</p><p>　　Flook和Rowell測定了29 種多新翅類( Polyneop tera)昆蟲的18S rDNA 的全序列,并結合Gen2Bank數據庫中的8 種其它昆蟲的18S rDNA 全序列,重建了傳統(tǒng)的古

10、翅亞部( Palaeop tera)和新翅亞部(Neop tera)昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育,其結果支持直翅目的單系性[ 7 ] 。劉殿鋒等人測定了斑腿蝗科(Catantop idae) 10亞科20種蝗蟲和其它蝗科3種蝗蟲的線粒體16S rDNA 部分序列,并從GenBank中下載了蝗亞目(Locustodea) 15個種的16S rDNA相應序列片段,構建了系統(tǒng)發(fā)育樹,但分子系統(tǒng)學研究結果和基于形態(tài)特征的斑腿蝗科傳統(tǒng)分類結果有很大的不同[8]

11、 。</p><p>　　1.2 RAPD 和RFLP技術</p><p>　　RAPD技術是由美國杜邦公司的科學家Williams和加利福尼亞生物研究所Welsh兩個研究小組在1990發(fā)展起來的以PCR為基礎的一項DNA分子水平上的大分子多態(tài)檢測技術[ 9 ]。其原理是用隨機序列的9 - 10個核苷酸的引物對基因組的DNA進行PCR擴增,再進行電泳分離與溴化乙錠染色。RAPD 技術具有簡

12、便、快捷、靈敏、多態(tài)性檢出率高、所需DNA量少等特點,因此被迅速用于個體和品系鑒定、基因的多態(tài)分析、基因定位、構建遺傳圖譜、標記輔助選擇和種間遺傳分析等領域的研究。目前RAPD技術已成為昆蟲遺傳圖譜構建中的一種普遍方法,該技術一出現,就被用于蚊蟲的分子系統(tǒng)學研究。</p><p>　　南宮自艷等采用RAPD技術,分析了5種松毛蟲10個地理種群的種群內、種群間的遺傳多樣性,檢測和描述在不同地理環(huán)境條件下的松毛蟲種群

13、的遺傳結構和變異情況,為松毛蟲的綜合防治提供有效的依據[ 10 ] 。趙慧婷等采用RAPD 技術對來自中國境內8個省市的28群東方蜜蜂Apis cerana進行了研究,探討了它們之間的親緣關系[ 11 ] 。</p><p>　　RFLP技術(限制性片段長度多態(tài)性分析)是由Bostein在1980年首先建立并發(fā)展起來的一種分子遺傳標記技術。它是指應用限制性內切酶切割不同類群個體基因組DNA或某一基因,產生不同長度

14、的限制性片段,根據酶切圖譜,計算類群之間的遺傳距離,構建系統(tǒng)樹。賈正輝等應用PCR - RFLP技術對來自四川省8個地方的枯死松樹樣品中的傘滑刃屬線蟲群體進行了分子鑒定。該研究中選用的4種限制性內切酶(DraⅠ、SalⅠ、HhaⅠ、AluⅠ)除SalⅠ外均可對所鑒定的6種傘滑刃屬線蟲產生特異性的酶切位點,從而均可有效地鑒別出松材線蟲、擬松材線蟲和其他4種傘滑刃屬線蟲,其結果可為今后這幾種傘滑刃屬線蟲的分子鑒定提供一定的參照[12] 。&

15、lt;/p><p><b>　　1.3分子雜交技術</b></p><p>　　核酸的分子雜交技術是現代分子生物學研究中常用的方法之一,它和克隆技術密不可分,并且在基因表達、調控以及在物種親緣關系的研究中具有重要作用。最基本的分子雜交技術包括原位雜交技術、Northern分子雜交技術和Southern分子雜交技術。在昆蟲學研究主要應用核酸分子技術檢測起遺傳的多態(tài)性、DNA

16、的同緣性和mRNA的差異來鑒別昆蟲的近緣種以及地理種群。分子雜交的關鍵是制備特異性強和靈敏度高的探針。目前應用較多的是地高辛和生物素等非放射性標記探針。Lorite等利用原位雜交對葉甲科Chrysomelidae昆蟲Chrysolinaam ericana的微衛(wèi)星進行了研究[13 ] 。</p><p>　　1.4SSCP和DSCP技術</p><p>　　SSCP技術(單鏈構象多態(tài)性分析

17、)及DSCP技術(雙鏈構象多態(tài)性分析)的基本原理相似,都是依據DNA分子在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時,其遷移率除與DNA的長短有關外,更主要的是取決于DNA鏈所形成的構象。SSCP技術自1989年由Masato Orita等人建立以來,就以其靈敏性廣受關注。李石柱等就使用PCR - SSCP技術對我國多斑按蚊復合體5個成員種進行了分子鑒別,分析其28S - D3擴增產物,結果顯示電泳條帶具種特異性,可用于鑒別各蚊種[ 14

18、] 。DSCP技術在昆蟲分類上的應用不多,在國內未見有相關報道。</p><p><b>　　2.問題與展望</b></p><p>　　隨著核酸序列分析、RAPD、RFLP、分子雜交、SSCP及DSCP等分子生物學技術在昆蟲分類研究中的應用和有益探索,或是解決了傳統(tǒng)分類中所存在的學術疑難問題,或是驗證了傳統(tǒng)分類所得出的結論,已顯示出其應有的優(yōu)勢和廣闊的發(fā)展前景。&l

19、t;/p><p>　　然而分子生物學技術在昆蟲研究中的應用時間畢竟不長,還存在不少問題。首先是目的基因或DNA片段的選擇,如何在龐大的昆蟲DNA文庫中選擇最有利于昆蟲分類、最能反映其進化關系的基因或DNA片段,仍存在較大難度。其次是用不同的目的基因或DNA片段對同一昆蟲進行研究,可能會得到不同的結果。再次是分析軟件或程序包的應用,目前有大量的分子生物學分析軟件,不同的軟件或程序包有許多不同的假設和參數,研究者采用不同

20、的分析軟件或采用同一軟件而設置不同的參數,同樣的數據可能會得到不同的結果。如何解決好這些問題是今后昆蟲分類科學研究工作中的重要任務。</p><p>　　隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展,實驗技術的不斷發(fā)展和改進,它必然會推動昆蟲學在分子水平上的發(fā)展。昆蟲分類學是昆蟲學研究中的基礎領域,也是傳統(tǒng)領域,可以預見在不遠的將來,古老的昆蟲研究隨著不斷創(chuàng)新的理論和技術的發(fā)展,將有新的更大的成就。</p><

21、;p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　[ 1 ]袁鋒. 研究內容和發(fā)展[A ].昆蟲分類學[M ] .北京:中國農業(yè)出版社, 1996, 1 – 6.</p><p>　　[ 2 ] Flook P K, Rowell C H F, Gellissen .The sequence, organizationand evolution of t

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25、lution from small subunit nuclear ribosomal DNAsequences[ J ]InsectMolecular Biology, 1998, 7 (2) : 163 – 178.</p><p>　　[ 8]劉殿鋒,蔣國芳,時號等.應用16S rDNA序列探討斑腿蝗科的單系性及其亞科的分類地位[ J ].昆蟲學報, 2005, 48 ( 5) : 759- 769.<

26、;/p><p>　　[ 9 ]Williams J G K, Kubelik A R. DNA polymorphisms amp lified byarbitrary p rimers are useful as genetic markers [ J ] NucAcidsRes, 1990, 18 (22) : 6531 – 6535.</p><p>　　[ 10]南宮自艷,高寶嘉,徐志

27、娥等. 松毛蟲屬5種松毛蟲不同地理種群RAPD遺傳多樣性分析[ J ]農業(yè)生物技術學報, 2009, 17(1) : 178 – 179.</p><p>　　[ 11 ]趙慧婷,高鵬飛,姜玉鎖等. 中國東方蜜蜂不同地理種群的RAPD分析[ J ].動物分類學報1 2008, 33 (1) : 89 – 96.</p><p>　　[ 12]賈正輝,朱天輝,楊佐忠.四川松材線蟲與擬松材線蟲

28、的PCR- RFLP鑒別[ J ].四川農業(yè)大學學報, 2012, 26 ( 2 ) : 205 -209.</p><p>　　[ 13 ]Lortie P, Palomeque T, Garner I, et al1 Characterization and chro2mosome location of satellite DNA in the leaf beetle Chrysolina am eri2c