生物科學(xué)畢業(yè)論文龍頭魚微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)及篩選

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　龍頭魚微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)及篩選</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物科學(xué)

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b><

3、/p><p>　　摘要錯誤!未定義書簽。</p><p>　　Abstract錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1.材料與方法2</b></p><p><b>　　1.1 材料2</b>&

4、lt;/p><p>　　1.1.1 儀器與設(shè)備2</p><p>　　1.1.2 藥品與試劑2</p><p><b>　　1.2實驗方法2</b></p><p>　　1.2.1龍頭魚基因組DNA的提取2</p><p>　　1.2.2 酶切3</p><p>　　

5、1.2.3 接頭的制備與連接3</p><p>　　1.2.4龍頭魚基因組文庫的建立3</p><p>　　1.2.5探針雜交和磁珠富集4</p><p>　　1.2.6富含微衛(wèi)星序列的PCR產(chǎn)物及測序4</p><p>　　1.2.7微衛(wèi)星PCR引物和電泳5</p><p>　　1.2.8聚丙烯酰胺凝膠銀染

6、5</p><p>　　2. 結(jié)果與分析7</p><p>　　2.1 DNA提取結(jié)果7</p><p>　　2.2酶切及適宜基因組片段的獲得7</p><p>　　2.3菌落PCR檢測重組率8</p><p>　　2.4測序結(jié)果及序列分析9</p><p><b>　　3

7、.小結(jié)11</b></p><p>　　3.1磁珠富集法11</p><p>　　3.2測序結(jié)果及序列分析11</p><p><b>　　3.3 討論12</b></p><p><b>　　參考文獻15</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義

8、書簽。</p><p>　　千萬不要刪除行尾的分節(jié)符，此行不會被打印。在目錄上點右鍵“更新域”，然后“更新整個目錄”。</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　[摘要] 為了研究龍頭魚（Harpodon neherus）的群體遺傳結(jié)構(gòu)，本實驗采用富集文庫法構(gòu)建龍頭魚的微衛(wèi)星富集文庫。將龍頭魚基因組DNA用MseⅠ限制性內(nèi)切

9、酶精心酶切后，回收并純化250bp-1000bp左右的片段，用生物素標(biāo)記的簡單重復(fù)序列作探針與其雜交，雜交復(fù)合物結(jié)合到包被有鏈霉親和素的磁珠上，經(jīng)一系列的洗滌過程，去除磁珠表面不含有微衛(wèi)星的片段。將吸附在磁珠上的片段洗脫，PCR擴增放大，再進行克隆和測序，根據(jù)微衛(wèi)星兩端的保守序列設(shè)計引物，即可得到微衛(wèi)星分子標(biāo)記。從菌落中篩選出的90個陽性克隆進行測序，其中有62個具有微衛(wèi)星序列，所占的比例為68.9%。根據(jù)自行分離得到的序列共設(shè)計引物2

10、8對，其中有21對能成功擴增出條帶，對舟山海域的龍頭魚樣本進行群體遺傳多樣性研究，其中5對引物擴增出條帶清晰，多態(tài)性高的目的片段。篩選出的微衛(wèi)星標(biāo)記可為今后研究龍頭魚的分子遺傳育種提供有效的遺傳標(biāo)記。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 微衛(wèi)星；龍頭魚；種群多樣性；多態(tài)性；分子標(biāo)記。</p><p><b>　　Abstract</b></p><p&

11、gt;　　[Abstract] Partial genomic library was constructed in order to study the genetic structure of Harpadon nehereus. In this experiment, we isolated microsatellite DNA from Harpadon nehereus genome with this method. Har

12、padon nehereus genomic DNA was extracted and digested with restriction enzyme MseI. Fragments over 250bp were isolated and purified and then ligated with short linkers. This genomic DNA was hybridized with a biotin-label

13、ed microsatellite probe (CA) 15. The hybrid mixture was incubated</p><p>　　[Key words] Microsatellite; Harpadon nehereus; Population diversity; Polymorph; Molecular markers</p><p><b>　　引言&

14、lt;/b></p><p>　　龍頭魚（Harpodon neherus）屬于脊索動物門,硬骨魚綱,燈籠魚目,狗母魚科,龍頭魚屬。分布于印度洋和太平洋、我國南海、東海和黃海南部均產(chǎn)之，尤以浙江的溫、臺和舟山近海以及福建沿海產(chǎn)量較多。屬暖水性底層近岸魚類，緩潮時常到上層。一般只在近海作短距離移動。屬捕食性魚類，生長甚快。以3～4月和9～12月漁獲為大[1]。</p><p>　　微衛(wèi)

15、星(microsatellite) 是近十幾年來發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記技術(shù)，它是少數(shù)幾個核苷酸(1～6個) 多次重復(fù)的簡單序列，其中以雙核苷酸的重復(fù)最為常見。微衛(wèi)星具有多態(tài)性高， 提供的遺傳信息多，PCR擴增結(jié)果重復(fù)性好，以及在基因組中分散分布等優(yōu)點， 常應(yīng)用于物種遺傳多樣性、種群的親緣關(guān)系、遺傳圖譜的建立和基因定位、微衛(wèi)星DNA指紋庫的建立等[2-7]。由于微衛(wèi)星研究所用DNA的數(shù)量極少，非損傷性取樣或陳舊樣品就能進行有效分析，檢測種

16、群的生存力，并且可以利用歷史標(biāo)本完成操作，因此，該法適用于瀕危物種及進化的研究。微衛(wèi)星上不同長度的等位基因按簡單的孟德爾方式遺傳，由于微衛(wèi)星具有高度的多態(tài)性，在基因組中含量豐富且分布均勻等優(yōu)點，因此成為目前研究種群遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的最有力的分子標(biāo)記之一。</p><p>　　本文研究的目的是利用富集法建立微衛(wèi)星富集文庫，進行測序分析、基因分型后篩選到一批具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，可以用于后續(xù)的檢測龍頭魚

17、個體基因型，統(tǒng)計群體中的微衛(wèi)星位點等位基因的數(shù)目和頻率，結(jié)合分子遺傳學(xué)和數(shù)量分類學(xué)原理，計算遺傳變異程度、生存穩(wěn)定性，用于評估龍頭魚的遺傳多樣性[8-10]。為龍頭魚分子遺傳學(xué)研究奠定良好的基礎(chǔ)。</p><p><b>　　1.材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 材料</b></p><p>　　1.

18、1.1 儀器與設(shè)備</p><p>　　PCR儀(MyCycler和S1000)為BIO-RAD公司生產(chǎn)，DYY-10C型電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)，凝膠成像系統(tǒng)由BIO-RAD公司生產(chǎn)，YXQ-LS-50A型壓力蒸汽滅菌鍋由上海云泰儀器儀表有限公司生產(chǎn)，HHS型電熱恒溫水浴鍋由上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)，微型離心機（Qspin BAYGENE），干燥箱（PH070A型，上海-恒科學(xué)儀器有限公司），超凈工

19、作臺（SB—JC—IA型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），電子天平（BS124S型，塞多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司），超純水器（DPWS-T-20L/H型，杭州永潔達凈化科技有限公司），錐形瓶（容量200mL，250mL，500mL中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司），燒杯（容量50mL，100mL，500mL，1000mL，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），量筒（容量50mL，100mL，500mL中國醫(yī)藥（集團）上海化學(xué)試劑公司），EP

20、管，移液槍Eppendorf Research可調(diào)量程移液。</p><p>　　1.1.2 藥品與試劑</p><p>　　苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:l)，Tris-Hcl，EDTA，SDS，蛋白酶K、Taq酶、dNTP均由Tiangen公司生產(chǎn)，限制性內(nèi)切酶MseⅠ，Mse-Ⅰ-N，TEN100，TEN1000，TE，PMD18-T，Solutron-Ⅰ，X-Gal，I

21、PTG，硝酸銀，無水乙醇，75%乙醇，氫氧化鈉，10%APS（烷基磺酸），甲醛溶液，TEMED（四甲基二乙胺），親和硅烷，剝離硅烷，瓊脂粉，酵母浸膏，Bis-acrylamide（甲叉雙丙烯酰胺），尿素，acrylamide（丙烯酰胺），磁珠，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209-02）購自天根生化科技(北京)有限公司，PCR擴增引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司生產(chǎn)。</p><p><b>　　1.2

22、實驗方法</b></p><p>　　1.2.1龍頭魚基因組DNA的提取</p><p>　　實驗用龍頭魚樣本采自于舟山海域，按酚/氯仿抽提法從龍頭魚尾鰭中提取基因組DNA的詳細方法和步驟如下[5][11]：</p><p>　　(l) 將樣品放入離心管剪碎。加入300 μL裂解液(0.02M Tris-Hcl，0.05M EDTA，l%SDS)，于振蕩

23、器上震蕩均勻。</p><p>　　(2) 加入蛋白酶K 6-7μL后，放入恒溫水槽37℃水浴3-4小時至溶液澄清，期間約30min顛倒混勻一次。</p><p>　　(3) 從水槽中出后涼至室溫，加300μL等體積苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:l)，溫和顛倒混勻至乳濁10min。</p><p>　　(4) 離心(10000r/min)10min，小心吸取上清液

24、至另一新的干凈離心管。</p><p>　　(5) 重復(fù)步驟3、4 ，3-4次。盡量使上清液保持澄清。</p><p>　　(6) 在得到的上清液中加入600μL 冰乙醇（無水，體積為苯酚:氯仿:異戊醇的2倍）10000r/min離心10min。</p><p>　　(7) 此時離心管底部能看到絮狀的沉淀，小心的棄去上清，加入70%乙醇約100μL，緩緩吹洗DNA絮

25、狀沉淀，10000r/min離心10min后棄上清。</p><p>　　(8) 重復(fù)步驟7，1-2次(注：不要將DNA沉淀倒掉)。</p><p>　　(9) 將DNA樣品置于金屬加熱器中干燥(視管中乙醇殘留量多少適當(dāng)調(diào)整干燥時間)，加入適量TE(10mM Tris-HCL，lmM EDTA，pH8.0)溶解，置4℃冰箱待用或長期保存于-20℃待用。</p><p&g

26、t;<b>　　1.2.2 酶切</b></p><p>　　基因組DNA利用限制性內(nèi)切酶酶切，具體步驟按照限制性內(nèi)切酶說明書進行。</p><p>　　1.2.3 接頭的制備與連接</p><p>　　用單鏈的寡核苷酸制備接頭，每種單鏈寡核苷酸的濃度均為10 μmol /L。本實驗采用Brown接頭：等比例混合兩組寡聚核苷酸鏈，這兩條鏈的序列

27、是OligoA和OligoB，首先95 ℃變性10 min，然后緩慢冷卻至室溫，最終形成雙鏈接頭。建立20 μL 的反應(yīng)體系( 接頭10μmol /L，1 .5 μL；T4 DNA 連接酶1 μL，10 × Buffer2 μL，純化的酶切片段10 μL，無菌水補足體積至20 μL) 。16 ℃連接過夜。</p><p>　　1.2.4龍頭魚基因組文庫的建立 </p><p>　

28、　1.2.4.1 PCR擴增</p><p>　　PCR程序：94℃變性5分鐘，94℃30s；55℃1min；72℃1min，30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸10分鐘。</p><p><b>　　連接產(chǎn)物PCR反應(yīng)</b></p><p>　　10×Buffer 5μL</p><p>　　dNT

29、P 3μL</p><p>　　Mse-Ⅰ-N 10μL</p><p>　　Taq 0.8μL</p><p>　　10×稀釋鏈接液 20μL</p><p>　　ddH2O補至 50μL</p><p>　　1.2.4.2特定大小的DNA片段的回收&

30、lt;/p><p>　　瓊脂糖電泳10-15分鐘，紫外燈下切膠回收250-300bp以上的膠裝入EP管，然后利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。</p><p>　　1.2.5探針雜交和磁珠富集</p><p>　　詳細步驟參考文獻[12]</p><p>　　1.2.6富含微衛(wèi)星序列的PCR產(chǎn)物及測序</p><p&

31、gt;　　1.2.6.1 連接載體</p><p>　　將純化的PCR產(chǎn)物與T載體鏈接，按照以下體系于16℃連接過夜</p><p>　　PMD18-T 1μL</p><p>　　DNA 4μL</p><p>　　Solution-Ⅰ 5μL</p><p>　　1.

32、2.6.2克隆、轉(zhuǎn)化和陽性克隆的挑選</p><p>　　連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中(100μL分成50μL2管)，然后冰浴30min，42℃熱激90s，然后再冰浴3min。之后加入300-400μL LB(不含Amp)搖床2h(37℃，<200r)。然后把菌液涂到預(yù)先涂過X-Gal 40μL和IPTG 10μL的平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜[13]。</p><p>　　隔天

33、早上就可以挑選陽性克隆，在超凈臺中挑選已經(jīng)轉(zhuǎn)入目的DNA的白色菌株，加入事先加入500μL LB的離心管中。</p><p>　　1.2.6.3 菌落PCR</p><p><b>　　根據(jù)以下體系：</b></p><p>　　Tap酶 0.4μL</p><p>　　10×Buffer

34、 1.5μL </p><p>　　dNTP 1.2μL</p><p>　　P1 0.3μL</p><p>　　P2 0.3μL</p><p>　　菌液 1μL</p><p>　　H2O 補足到15μL</p><

35、;p>　　菌落PCR反應(yīng)程序為：95℃變性5min ，95℃ 30s ；55℃ 30s ；72℃ 40s ，30個循環(huán)，72℃延伸10min</p><p>　　1.2.6.4 檢測</p><p>　　取1μL左右用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測后我們挑選300bp以上的陽性克隆寄出去測序。序列的測定由商業(yè)公司(上海美季生物公司)完成。</p><p>

36、　　1.2.7微衛(wèi)星PCR引物和電泳</p><p>　　1.2.7.1微衛(wèi)星的PCR引物</p><p>　　從測序結(jié)果而開發(fā)的28對微衛(wèi)星引物中多樣性分析：</p><p><b>　　PCR的體系為以下</b></p><p>　　Taq酶 0.4μL</p><p>

37、;　　dNTP 1.2μL</p><p>　　10×Buffer 1.5μL</p><p>　　DNA 0.6μL</p><p>　　引物1 1μL</p><p>　　引物2 1μL</p>&

38、lt;p>　　ddH2O 補足到15μL</p><p>　　PCR反應(yīng)程序為：95℃變性5min，95℃30s；52℃30s；72℃ 30s，30個循環(huán)。72℃延伸5min。</p><p>　　1.2.7.2 電泳</p><p>　　(1) 電泳裝置的準(zhǔn)備，將玻璃板充分洗凈，在玻璃上分別涂上剝離硅烷和親和硅烷。涼干后，放上膠條，將兩塊裝好，放平

39、。</p><p>　　(2) 灌膠，用l00mL量筒量取50ml 6%聚丙烯酰胺貯備液，(含TBE)，250μL 10%APS和30μL TEMED。充分混勻?；靹蚝笱杆俟嗄z，期間用吸耳球輕輕敲打，使膠均勻擴散，完成后在板一側(cè)慢慢插入梳子，注意梳齒下不要有氣泡產(chǎn)生，室溫聚合2h以上。</p><p>　　(3) 將聚合好的PAGE膠組裝到電泳儀上，擰緊螺絲。</p><

40、;p>　　(4) 在DNA加入等體積的變性劑，96℃變性9min，迅速放入-20℃冷卻待點樣。</p><p><b>　　(5) 點樣。</b></p><p>　　(6) 電泳，向膠槽中倒入電泳緩沖液(1×TBE)，200W電泳2h左右[14-17]。</p><p>　　1.2.8聚丙烯酰胺凝膠銀染</p>

41、<p>　　銀染色法是近年來建立的一種非放射性核素標(biāo)記的核酸序列測定方法。原理是通過高靈敏度的銀鹽顯色步驟來檢測末端終止法完成的測序凝膠其具體步驟及注意事項為[18]。</p><p>　　(1) 固定：電泳后的PAGE把玻璃拿下來，把帶膠的放入75%的乙醇1L搖動15min(以前沿指色為準(zhǔn))固定可過夜。(注意:固定液不可用太多次，最好4-5次換液)</p><p>　　(2)

42、水洗：純水1L，搖動10min</p><p>　　(3) 銀染：將水洗后的凝膠放入染色液(硝酸銀1.8g，水1L，甲醛3mL) 15min。(注意：當(dāng)外界溫度較高時(一般15℃以上)染色時間和顯色時間應(yīng)縮短，且染色效果較好；當(dāng)環(huán)境溫度較低時(15℃以下)，要相應(yīng)的延長時間和顯色時間，也可用增加染色液和顯色液的濃度來代替時間的延長</p><p>　　(4) 水洗：倒掉染色液，水洗10s。

43、(注意:染色后洗膠，作用是洗去沒有和DNA嵌合的Ag+，因此，洗膠時間過短，沒有嵌合的Ag+不能完全被洗掉，造成背景色較深、對比度較小、甚至看不出電泳條帶;若洗膠的時間過長，與DNA嵌合的Ag+也會被洗掉，造成電泳條帶染色較淺，甚至完全脫色)。</p><p>　　(5) 顯影：將凝膠放入顯色液(氫氧化鈉20g，甲醛4mL，水1L)中以顯出清晰的帶為標(biāo)準(zhǔn)。一般約10min就可以(顯色液先預(yù)冷顯色效果更佳)<

44、/p><p>　　(6) 水洗：純水1L，洗去多余的NaOH，然后晾干，留以后分析用。</p><p><b>　　2. 結(jié)果與分析</b></p><p>　　2.1 DNA提取結(jié)果</p><p><b>　　圖1：DNA的提取</b></p><p>　　Fig.1：DNA

45、 extraction</p><p>　　圖1是總DNA的提取，從圖中可以看出DNA的提取效果還是不錯的，DNA基本被提取出來，有個別條帶比較暗，可能DNA含量比較少。</p><p>　　2.2酶切及適宜基因組片段的獲得</p><p><b>　　圖2 ：酶切</b></p><p>　　Fig.2：Digesti

46、on</p><p>　　從圖2可以看出基因組經(jīng)MseⅠ酶切后經(jīng)瓊脂糖電泳，條帶比較暗，可能是酶切效果不是很理想，但是在250-1000bp左右還是有帶的，回收后范圍在250bp-1000bp左右的片段，就是我們所需要的目的帶。</p><p>　　2.3菌落PCR檢測重組率</p><p>　　圖3：陽性克隆子挑選</p><p>　　Fi

47、g3：selected positive clones</p><p>　　圖3為挑選陽性克隆子后的瓊脂電泳檢測，從圖3中可以看出，插入片段大多數(shù)在300-500bp之間，然后從結(jié)果里挑取分子量較大的，并且是單條帶的，寄出去測序。以上瓊脂電泳所使用的都是DL2000的Marker作為分子量參照。</p><p><b>　　圖4：銀染效果圖</b></p>

48、<p>　　Fig5： Result of silver staining</p><p>　　圖4為銀染法對龍頭魚微衛(wèi)星多態(tài)性的檢測。將擴增出來具有多態(tài)性的5對引物進行聚丙烯酰胺凝膠銀染，從圖4中可以看出，這5對引物具有明顯的多態(tài)性。</p><p>　　2.4測序結(jié)果及序列分析</p><p>　　表1 龍頭魚5個微衛(wèi)星分子標(biāo)記及其引物序列<

49、;/p><p>　　Table 1 5 Microsatellite markers and their primers sequences from Harpodon nehereus</p><p>　　在獲得的90個重復(fù)5 次以上的微衛(wèi)星序列中，除了微衛(wèi)星側(cè)翼序列太短沒有設(shè)計引物外，其余微衛(wèi)星序列都用軟件Primer 5.0 設(shè)計引物，共設(shè)計28對引物。PCR 檢測篩選出21 對能擴增出

50、特異性條帶的引物，再用36個不同龍頭魚基因組DNA 檢驗其多態(tài)性，最終確定5對引物具有良好的多態(tài)性，可作為龍頭魚的分子標(biāo)記使用。這5對引物的具體信息如表1。</p><p>　　表2 龍頭魚5個微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記特征的描述</p><p>　　Table 2 Polymorphism evaluation at 5 microsatellite loci in Harpodon neher

51、eus</p><p>　　*In the types, P, I and C respectively means Perfect, Imperfect and Compound. Tm= annealing temperature; NA= number of alleles; </p><p>　　PIC=polymorphism information content; HO=ob

52、served heterozygosity and HE= expected heterozygosity.</p><p>　　對龍頭魚微衛(wèi)星序列設(shè)計的28對引物進行分析，其中發(fā)現(xiàn)有21引物對可以擴增出清晰的微衛(wèi)星條帶，所占的比例還是占68.90%，但是其中只有5對具有多態(tài)性，所占的比例也僅有23.81%。通過利用36個個體對能夠擴增典型微衛(wèi)星條帶的位點進行主要遺傳學(xué)參數(shù)的估算，結(jié)果顯示5對引物具有高多態(tài)性。對

53、具有良好多態(tài)性的5 對引物擴增的數(shù)據(jù)進行多態(tài)性分析，其等位基因數(shù)、觀測雜合度( Ho) 等的統(tǒng)計分析結(jié)果如表2。在5個微衛(wèi)星位點上共獲得了18個等位基因，平均每個位點擴增得到3.6000個等位基因，不同引物獲得的等位基因數(shù)差別比較大的，從3 ~4個不等，其中Hane-23、Hane-154 兩個位點分別獲得了3個等位基因，而Hane-50、Hane-97、Hane-175都只有4個等位基因。多態(tài)信息含量在0.4403~0.5538，根據(jù)

54、BOTSEIN 等的分類方法，有4個位點的PIC 值高于0.5，顯示出高度多態(tài)性；只有1個位點的PIC 值介于0.25~0.5，顯示出中度多態(tài)性，說明所篩選的引物大部分具有高度多態(tài)性，同時PIC 值的高低也反映在Ho和He上。從表格中顯示觀測雜合度和期望雜合度分別介于0.3</p><p>　　千萬不要刪除行尾的分節(jié)符，此行不會被打印。“結(jié)論”以前的所有正文內(nèi)容都要編寫在此行之前。</p><

55、p><b>　　3.小結(jié)</b></p><p><b>　　3.1磁珠富集法</b></p><p>　　磁珠富集法是一種高效而簡單快速的篩選微衛(wèi)星的方法，整個過程可在1個星期左右完成，利用藍白斑篩選克隆，從理論上講，每一個白色菌斑都應(yīng)當(dāng)含有微衛(wèi)星序列。但是，操作過程中一些因素會影響篩選微衛(wèi)星效率，最主要的影響因素是磁珠的平衡及洗液和洗滌

56、溫度的嚴(yán)格控制。磁珠用前需要用反復(fù)平衡，洗液的配置及洗滌溫度要嚴(yán)格控制，以達到清除不含微衛(wèi)星序列片段的目的，同時，保護吸附的含有微衛(wèi)星序列的片段不被洗脫，整個操作過程要輕，以達到最高的分離效率.。</p><p>　　3.2測序結(jié)果及序列分析</p><p>　　我們對菌落PCR 篩選出的90個陽性克隆進行測序，成功獲得62 (68.9%)個含有微衛(wèi)星序列的克隆。這種方法通過一次PCR 擴

57、增即可從大量轉(zhuǎn)化子中篩選出含微衛(wèi)星的陽性克隆，操作簡單快捷，成本較低，準(zhǔn)確性高，同時避免了同位素污染環(huán)境，危害人體等缺點，非常適合大量微衛(wèi)星序列的篩選。但是PCR 法過于靈敏，經(jīng)常會出現(xiàn)非特異性擴增條帶，要減少非特異性條帶的產(chǎn)生可通過改善PCR 的條件或通過設(shè)立陰性克隆的對照來篩選。有研究者認為，微衛(wèi)星富集法雖然使陽性克隆率提高，但獲得有用序列的概率并不高[19]。經(jīng)常是由于插入片段過短、側(cè)翼序列太短或二級結(jié)構(gòu)過多，不足以設(shè)計高質(zhì)量的引

58、物。從本次研究來看，該結(jié)論成立。</p><p>　　多態(tài)信息含量(PIC) 能反映出某個標(biāo)記所包含或所提供的遺傳信息容量，當(dāng)PIC > 0.5 時，表明該標(biāo)記可提供豐富的遺傳信息；當(dāng)0.25 <PIC <0.5時，表明該標(biāo)記可提供較為合理的遺傳信息；當(dāng)PIC <0.25 時，表明該標(biāo)記可提供的遺傳信息較差[20]。本研究中的5個微衛(wèi)星位點PIC均大于0.25，且大部分為高度多態(tài)性位點，因

59、此這些位點可為龍頭魚遺傳學(xué)分析提供有效的依據(jù)。雜合度的高低反映了群體在多個基因上的遺傳變異及群體遺傳多樣性豐富度。由表2可知，PIC >0.5 的4對引物的Ho為0.3500 ~0.8421，He為0．5914~0．6244， 0.25 < PIC <0.5 的1對引物的Ho為0.8000，He為0.5244，表明龍頭魚具有較高的遺傳多樣性。</p><p><b>　　3.3 討論&

60、lt;/b></p><p>　　微衛(wèi)星分子標(biāo)記在水產(chǎn)動物的分離和應(yīng)用起步較晚，遠落后于陸生動植物，大多還處于尋找合適的標(biāo)記為遺傳結(jié)構(gòu)分析、 圖譜構(gòu)建及進一步研究打基礎(chǔ)的初級階段，在國內(nèi)，只有鯉、對蝦、扇貝等少數(shù)種類已分離出微衛(wèi)星分子標(biāo)記，網(wǎng)上基因庫可利用的資源也還非常有限，遠不能滿足研究和應(yīng)用的需要。分離微衛(wèi)星所用的方法也主要是用微衛(wèi)星探針篩選常規(guī)小片段基因組文庫，費時費力，且陽性克隆率也非常低。本方法為

61、水產(chǎn)動物微衛(wèi)星的分離提供了廣闊前景。</p><p>　　我國是一個漁業(yè)大國，水產(chǎn)動物種類多，數(shù)量多，遺傳特性復(fù)雜，依靠微衛(wèi)星引物的通用性進行遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建、QTL定位基因、分子標(biāo)記輔助育種等研究具有很大的局限性。可以預(yù)見，通過對水產(chǎn)動物微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記的開發(fā)可以加速水產(chǎn)遺傳種質(zhì)分析的研究進展。</p><p>　　微衛(wèi)星序列廣泛且隨機分布于真核生物基因組中，特別是兩堿基重復(fù)類

62、型( AC) n 含量十分豐富，如在魚類基因組中，以( AC) n、( AG) n 分布最為廣泛[21]；中國對蝦( Penaeus chinensis) 中CT /GA 的含量非常豐富[22]。海洋生物同許多其他陸生動物一樣，兩堿基重復(fù)在是基因組中是最豐富的類型之一，而從結(jié)果中可以看出兩堿基重復(fù)中的GA/CT和CA/GT重復(fù)占兩堿基重復(fù)中占更大的比例。故本研究采用了兩堿基探針(GA)15和(CA)15構(gòu)建龍頭魚的微衛(wèi)星富集文庫，實際也

63、顯示出了良好的效果，結(jié)果絕大部分微衛(wèi)星序列與探針序列相符，只是重復(fù)長度有所差別，這說明CT /GA 在龍頭魚基因組中分布廣泛且含量豐富。在龍頭魚基因組中觀察到兩堿基重復(fù)類型，研究結(jié)果表明重復(fù)次數(shù)處于5—15之間，說明龍頭魚基因組中存在不少較長的微衛(wèi)星片斷。由于本研究采用的探針類型僅為(GA)15這一種探針，而且經(jīng)測序的克隆數(shù)也較少，因此對龍頭魚微衛(wèi)星的分布特征和規(guī)律的認識有一定局限性，要想對龍頭魚微衛(wèi)星的分布特征和規(guī)律有一個全面充分的認

64、識，需要同時采用更多類型的探針，并且需要挑取大量的克隆進行</p><p>　　本研究構(gòu)建了部分龍頭魚基因組文庫，對設(shè)計合成的21 對引物進行篩選，最終獲得了特異性強，多態(tài)性良好的5 對微衛(wèi)星分子標(biāo)記，為揭示龍頭魚的種群多樣性以及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、QTL 定位及對其進行更深入地研究提供了基礎(chǔ)資料。</p><p>　　微衛(wèi)星的多態(tài)性可能直接與其核心序列的長短有關(guān)，核心序列越長， 突變率越

65、高，多態(tài)性越好(Wierdle et al1, 1997) 。作為具有多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，微衛(wèi)星核心序列的重復(fù)次數(shù)可能存在一個最低閾值。根據(jù)高煥等(2004)的研究，14或14次以上的重復(fù)單堿基重復(fù)序列， 7或7次以上的重復(fù)雙堿基重復(fù)序列，5或5次以上的重復(fù)三堿基重復(fù)序列，4或4次以上的重復(fù)四堿基重復(fù)序列，3或3次以上的重復(fù)五六堿基重復(fù)序列可以統(tǒng)計為微衛(wèi)星序列。從龍頭魚中篩選出的5個微衛(wèi)星座位中,兩堿基重復(fù)微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)為分別為8次、12

66、次、13次、14次，11次。因此，這些微衛(wèi)星座位都可能是有效的遺傳標(biāo)記。</p><p>　　微衛(wèi)星技術(shù)是基礎(chǔ)和應(yīng)用研究相結(jié)合的典范，在最近幾年不斷取得新的進步，正朝著自動化、精確分析等方向發(fā)展。但仍存在很多問題有待改進：如在微衛(wèi)星位點的開發(fā)上雖然已經(jīng)有了很多改進的方法，包括不用構(gòu)建基因組文庫的ISSR2PCR 等分離的方法，但這些方法本身導(dǎo)向性太強，如只能克隆CA 或A T 等某一類單一核心重復(fù)的序列，如何開發(fā)

67、新的重復(fù)序列的分析方法仍需要改進，如是否可以考慮直接利用DNA 序列復(fù)性的特性篩選出低Cot值的序列，進而構(gòu)建基因組文庫？同時微衛(wèi)星技術(shù)本身還存在一些缺陷需要完善,：如存在無效等位基因位點、非特異性擴增帶和影子帶等現(xiàn)象。技術(shù)總是在實踐探索中不斷得到完善和發(fā)展，微衛(wèi)星技術(shù)仍然還在發(fā)展中，這給我們提供了更多和更深入的研究思路，如隨著微衛(wèi)星位點在各種生物基因組中的大量開發(fā)，可以想象的是，以微衛(wèi)星技術(shù)為基礎(chǔ)的比較遺傳學(xué)或比較基因組學(xué)研究也將慢慢

68、發(fā)展起來，這也是目前我們努力研究的方向。</p><p>　　微衛(wèi)星在不同物種中的變異速率并不相同，但總體而言，變異速率較低,成為親子鑒定和系譜關(guān)系分析的有力工具。伴隨著各種海洋經(jīng)濟生物育種項目的展開，目前借助于微衛(wèi)星技術(shù)進行分子輔助育種的研究工作已經(jīng)開始：如我們利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)對中國明對蝦進行了家系識別[23]和混養(yǎng)家系中父母本的鑒別等工作[24]，取得了初步研究成果。</p><p&

69、gt;　　微衛(wèi)星DNA 技術(shù)作為群體遺傳關(guān)系分析有力的工具，將促進對水產(chǎn)動物遺傳基礎(chǔ)的深入了解，為物種起源和進化、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源收集鑒定提供更科學(xué)的理論依據(jù)，從而推動水產(chǎn)動物的遺傳育種工作。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 韓素珍，董明敏. 龍頭魚Harpodon nehereus營養(yǎng)成分的分析[J]. 學(xué)報， 199

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