日本沼蝦微衛(wèi)星標記開發(fā)、遺傳結構分析及性別相關遺傳標記篩選研究.pdf

1、日本沼蝦隸屬十足目、長臂蝦科、沼蝦屬，自然分布于中國、日本、越南及俄羅斯遠東地區(qū)，在我國各地淡水水域中都有分布。日本沼蝦的養(yǎng)殖始于二十世紀五十年代，從2004年起，我國日本沼蝦的年養(yǎng)殖產量就超過了20萬噸。多年來，日本沼蝦在市場上一直供不應求，暢銷不衰，是一種養(yǎng)殖效益非?？捎^的淡水蝦類。但長期以來，繁殖日本沼蝦用的親本多為野生個體，未經過系統(tǒng)選育，日本沼蝦的養(yǎng)殖單產較低，且多是套養(yǎng)在各種魚類的養(yǎng)殖池塘中，主養(yǎng)日本沼蝦的池塘較少。因此開展

2、日本沼蝦的種質資源保護、良種選育工作是當前日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)中亟待解決的問題。由于當前已知的日本沼蝦微衛(wèi)星標記只有二十多個，這嚴重地限制了日本沼蝦的群體遺傳結構分析、種質資源評價等工作;此外，日本沼蝦雄性生長速度顯著大于雌性，開展單性苗種培育意義重大，但當前沒有鑒別日本沼蝦遺傳性別的分子標記，使得單性苗種培育工作一直無法得以開展。本論文的研究內容主要包含如下3個方面:
　　1.日本沼蝦多態(tài)性微衛(wèi)星標記的開發(fā):
　　(1) FIA

3、SCO法開發(fā)微衛(wèi)星標記。通過生物素標記的探針(GT)13和(GA)13富集微衛(wèi)星序列，共獲得含微衛(wèi)星的序列334個，成功設計引物110對，設計引物的序列含有的微衛(wèi)星重復多為2堿基重復，重復數(shù)多數(shù)在10次以上。設計的引物擴增的目的條帶大小在95-356 bp之間。多態(tài)性分析顯示，24對引物擴增出的條帶為清晰穩(wěn)定的多態(tài)，開發(fā)效率（多態(tài)性引物占總設計引物的百分比）為21.8％。各位點等位基因數(shù)介于2-9之間，各等位基因的大小范圍在111-33

4、4bp之間;各位點期望雜合度(He)在0.1905-1.0000之間，各位點的觀測雜合度(Ho)在0.1765-0.8090之間，除個別位點外(X781、X63、Z339)期望雜合度（Ho）與觀測雜合度（Ho）均在0.3以上;各等位基因的多態(tài)信息含量(PIC)在0.1574-0.8272之間，其中X781與Z339兩個位點的PIC值在0.25以下，屬于低度多態(tài)性位點;X195等5個位點的PIC值在0.25與0.5之間，屬于中度多態(tài)性位點

5、;其余的17個位點的PIC值皆大于0.5，屬于高度多態(tài)性位點。經Bonferroni法校正(P＜0.003)后，24個多態(tài)性微衛(wèi)星位點中有9個微衛(wèi)星位點偏離了Hardy-Weinberg平衡，其中有2個位點(X1214、Z167)表現(xiàn)出顯著的雜合子缺失(Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)D＜0，D=(Ho-He)/He），其他7個位點表現(xiàn)出顯著的雜合子過剩(Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)D＞0)。
　　(2) IS

6、SR-PCR法開發(fā)微衛(wèi)星標記。設計的8對簡并引物中用于擴增CA/GT重復單元的引物PCA6、PGT6、PTG6、PAC6能夠擴增出亮度較大的彌散帶，將這四對簡并引物克隆后測序。將前人已經開發(fā)出的微衛(wèi)星同源序列去除后，共獲得含微衛(wèi)星的序列114個，成功設計引物45對。多態(tài)性分析顯示，23對引物擴增條帶為多態(tài)，開發(fā)效率為51.1％。各位點等位基因數(shù)介于2-12之間;各等位基因的大小范圍在141-324bp之間;各位點期望雜合度(He)在0.

7、2357-1.0000之間，各位點的觀測雜合度(Ho)在0.3203-0.9169之間;各等位基因的多態(tài)信息含量(PIC)在0.2894-0.8877之間，其中4個位點(B78、B96、B75、D30) PIC值在0.25-0.5之間，屬于中度多態(tài)位點，其他位點的PIC值都大于0.5，屬于高度多態(tài)位點。經Bonferroni法校正(P＜0.003)后，23個多態(tài)性位點中6個微衛(wèi)星位點偏離了Hardy-Weinberg平衡，其中有三個位點

8、(B96、B73、B92)表現(xiàn)出顯著的雜合子缺失(Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)D＜0，D=(Ho-He)/He)，另外三個位點(A89、B75、C2)表現(xiàn)出顯著的雜合子過剩（Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)D＞0）。
　　(3)微衛(wèi)星序列特征分析
　　對391條含微衛(wèi)星重復的序列進行統(tǒng)計分析（圖3-7），發(fā)現(xiàn)獲得的微衛(wèi)星序列長度范圍在60-852 bp之間，100 bp以下的最少（16個）。大部分克隆片段

9、大小在200bp以上，占總序列的83.1％。日本沼蝦的微衛(wèi)星序列中以二核苷酸重復最為豐富，占所有微衛(wèi)星序列類型數(shù)目的92.4％，其次是三核苷酸(1.8％)或四核苷酸重復(1.6％)。二核苷酸重復中以(CA/GT)n類型所占比例最高，占總微衛(wèi)星序列數(shù)的68.3％，其次是（GA/CT）n型，占25.1％，此外還有少量的(TA/AT)n型和(GC/CG)n型，分別占2.8％和0.6％。
　　2.4個日本沼蝦群體遺傳結構分析
　　利

10、用8個微衛(wèi)星標記(A28、A73、B13、B29、B44、B93、D7、Z337)對太湖、東平湖、微山湖、長江下游（崇明島附近水域）4個群體的遺傳結構進行分析，4個群體中長江下游（崇明島附近水域）群體的平均等位基因數(shù)最多，為13.5000，其次是微山湖群體為12.2500，太湖群體最低為11.87。微山湖群體的平均期望雜合度和觀測雜合度最高，分別為0.8403和0.8350;長江下游（崇明島附近水域）群體的最低，分別為0.7145和0.

11、7909。
　　各群體間遺傳距離分析顯示，微山湖和東平湖群體的遺傳距離最小，為0.0158;長江下游（崇明島附近水域）和微山湖的遺傳距離最大為0.3844。各群體間的遺傳相似度分析也得出了類似的結果，微山湖和東平湖的遺傳相似度最大(0.9162);長江下游（崇明島附近水域）和微山湖的遺傳相似度最小(0.6312)?；谶z傳距離的NJ和UPGMA聚類分析得到了相同的結果，東平湖群體和微山湖群體遺傳距離最小首先聚類為一支，再與太湖群體

12、聚為一支，最后和長江下游（崇明島附近水域）群體聚類為一支。聚類分析的情況和實際的地理距離相符。
　　4個日本沼蝦群體的分子方差分析（AMOVA）顯示，群體中89.29％的變異來源于個體內，僅有4.18％的變異來源于群體間，6.52％來源于群體內個體間，顯著性檢驗分析顯示這4個群體遺傳分化極顯著(P＜0.01)。4個群體兩兩間遺傳分化指數(shù)Fst從0.0031到0.0739，其中東平湖群體與長江下游（崇明島附近水域）群體、微山湖群體與

13、長江下游（崇明島附近水域）群體的0.05＜Fst＜0.15，屬于中等分化程度;其他群體間的Fst值均＜0.05，分化程度較弱。
　　日本沼蝦群體的遺傳結構分析對其種質資源保護和合理挖掘利用具有重要意義。
　　(3)性別相關標記的篩選:
　　在利用15雌和15雄日本沼蝦對開發(fā)的47個微衛(wèi)星標記進行多態(tài)性分析時，我們發(fā)現(xiàn)有8個SSR標記出現(xiàn)了雌性或雄性特異的等位基因。為此，我們合成了這8個微衛(wèi)星標記的上游熒光引物，利用熒光

14、SSR法，對另外的15雌和15雄日本沼蝦進一步進行分析、驗證。結果顯示，有7個微衛(wèi)星標記檢測到了雌性或雄性特異的等位基因（等位基因出現(xiàn)次數(shù)在2次以上）。
　　首先利用2個雌性個體和2個雄性個體對64對AFLP引物的擴增情況進行了篩選，對其中的9對引物進一步利用15個雌性個體和15個雄性個體進行大量分析。有8對檢測到分布頻率雌雄差異顯著的等位基因，其中雄性占絕大多數(shù)(90.9％)的等位基因有1個，雌性占絕大多數(shù)(84.6％)的等位基