振動耦合被動運動對尾吊大鼠骨液流的影響

1、<p>　　單位代碼 10006 </p><p>　　學 號 10101010 </p><p>　　1分類號 Q-331 </p><p>　　密 級 </p><p><b>　　畢業(yè)設(shè)計(論文)&l

2、t;/b></p><p><b>　　振動耦合被動運動</b></p><p>　　對尾吊大鼠骨液流的影響</p><p><b>　　2014年 6月 </b></p><p><b>　　北京航空航天大學</b></p><p>　　本科生畢

3、業(yè)設(shè)計（論文）任務(wù)書</p><p>　?、瘛厴I(yè)設(shè)計（論文）題目：</p><p>　　振動耦合被動運動對尾吊大鼠骨液流的影響 </p><p>　?、?、畢業(yè)設(shè)計（論文）使用的原始資料（數(shù)據(jù)）及設(shè)計技術(shù)要求：</p><p>　　原始資料：雌性SD大鼠

4、 </p><p>　　設(shè)計技術(shù)要求：熟練掌握振動耦合被動訓練裝置，大鼠尾吊技術(shù)，熟練掌握尾靜脈注射方法，會使用硬組織切片儀進行切片操作，可熟練操作激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像，會使用圖像分析軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，熟悉大鼠松質(zhì)骨骨密度及骨液流的計算方法。 </p><p>　　

5、Ⅲ、畢業(yè)設(shè)計（論文）工作內(nèi)容：</p><p>　?。?）熟練尾吊大鼠振動耦合被動運動訓練裝置的使用方法。因為研究振動耦合被動運動對尾吊大鼠骨液流的影響是實驗?zāi)康?，所以熟練使用尾吊設(shè)備及運動訓練裝置是實驗進行和完成的基礎(chǔ)和根本。</p><p>　　（2）熟練掌握尾靜脈注射方法。尾靜脈注射是后續(xù)進行骨組織切片的前提，熟練掌握本課題所用Reactive red分子示蹤劑的注射與制備方法，并通

6、過尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)。 </p><p>　?。?）熟悉掌握切片制作方法。運用適用于本課題的骨切片制備方法制備出可用于觀察的標本切片。 　　　　　　　　　　　　 </p><p>　　（4）利用共聚焦顯微鏡對所制得的切片進行觀察并得到圖像，并用適當?shù)膱D像分析軟件對骨陷窩個數(shù)、面積等參數(shù)進行測量、計算。 實驗結(jié)果

7、匯總分析，實驗數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進行統(tǒng)計學處理，探究局部振動耦合被動運動對尾吊大鼠骨液流的影響。 </p><p><b>　?、簟⒅饕獏⒖假Y料：</b></p><p>　　[1] 肖建德主編.實用骨質(zhì)疏松學[M].北京:科學出版社,2004.8 </p><p>　　[2] 馬永潔,元艷宏,謝力勤等.模擬失重及

8、力負荷對大鼠脛骨骨液流的影響[J].航天醫(yī)學與醫(yī)學工程,2003,4:54-57 </p><p>　　[3] Montgomery R J, Sutker B D, Bronk J T, et al. Interstitial fluid flow in cortical bone[J]. Microvascular research, 1988,

9、35(3): 295-307 </p><p>　　[4] Ciani C, Doty S B, Fritton S P. Mapping bone interstitial fluid movement: displacement of ferritin tracer during histological processing[J]. Bone, 20

10、05, 37(3): 379-387 </p><p>　　[5] Kwon R Y, Meays D R, Tang W J, et al. Microfluidic enhancement of intramedullary pressure increases interstitial fluid flow and inhibits bone loss in h

11、indlimb suspended mice[J]. Journal of Bone and Mineral Research, 2010, 25(8): 1798-1807 </p><p>　　[6] Tate M L K, Steck R, Forwood M R, et al. In vivo demonstration of load-i

12、nduced fluid flow in the rat tibia and its potential implications for processes associated with functional adaptation[J]. Journal of Experimental Biology, 2000, 203(18): 2737-2745 </p&g

13、t;<p>　　[7] Ciani C, Doty S B, Fritton S P. An effective histological staining process to visualize bone interstitial fluid space using confocal microscopy[J]. Bone, 2009, 44(5): 1015-1017 </p><p>　　

14、生物與醫(yī)學工程 學院 生物工程 專業(yè)類 101011 班</p><p>　　學生 李文婷 </p><p>　　畢業(yè)設(shè)計（論文）時間： 2014年 3月 3 日至 2014 年 6 月 4 日</p><p>　　答辯時間： 2014 年 6 月 10 日</p><p>　　成 績： &l

15、t;/p><p>　　指導教師： </p><p>　　兼職教師或答疑教師（并指出所負責部分）：</p><p>　　系（教研室）主任（簽字）： </p><p><b>　　本人聲明</b></p><p>　　我聲明，本論文及其研究工作是由本人在導師指導下獨立

16、完成的，在完成論文時所利用的一切資料均已在參考文獻中列出。</p><p><b>　　作者：李文婷</b></p><p><b>　　簽字：</b></p><p>　　時間：2014年 6 月</p><p>　　振動耦合被動運動對尾吊大鼠骨液流的影響</p><p>

17、;　　學 生：李文婷 </p><p><b>　　指導教師：孫聯(lián)文 </b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　隨著航天載人事業(yè)的蓬勃發(fā)展，宇航員失重性骨質(zhì)疏松現(xiàn)象越來越受到關(guān)注。目前普遍采取的對抗措施包括運動、藥物、企鵝服等，但對抗效果并不理想。振動近年來被認為是對抗骨質(zhì)疏松最

18、有應(yīng)用前景的方法之一。但是單獨振動的效果并不令人滿意，而與傳統(tǒng)抗阻訓練組合的振動訓練表現(xiàn)出了更大的優(yōu)勢。此外，骨液流被認為對營養(yǎng)運輸和骨細胞的新陳代謝有重要意義，研究骨液流的變化可能為探究失重性骨丟失的對抗措施提供依據(jù)。因此，本實驗主要研究振動耦合被動運動對尾吊大鼠骨液流的影響。</p><p>　　本實驗以雌性SD大鼠作為實驗對象，利用尾吊模擬失重環(huán)境，在尾吊階段，按照對照組、尾吊組、尾吊+振動組、尾吊+被動運

19、動組、尾吊+振動+被動運動組的分組分別進行實驗，通過分析骨陷窩的參數(shù)研究骨液流的變化情況。實驗結(jié)果顯示：大鼠尾吊會減少脛骨骨液流，增加尺骨陷窩個數(shù)而不影響其總面積，但對于頂骨并沒有顯著影響。同時，局部振動耦合被動運動訓練對大鼠脛骨、尺骨的骨液流都有積極的影響。這可能為研究失重性骨丟失的對抗措施提供了依據(jù)。</p><p>　　本實驗通過研究振動耦合被動運動對尾吊大鼠骨液流的影響，以期為進一步研究振動耦合被動運動訓

20、練對失重性骨丟失的對抗效果提供理論依據(jù)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：尾吊大鼠，振動耦合被動運動，骨液流，示蹤劑</p><p>　　Effects of vibration coupling passive movement on bone’s interstitial fluid flow in tail-suspension rat</p><p>　　Aut

21、hor: LI Wen-ting</p><p>　　Tutor: SUN Lian-wen</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　With the fast development of the shuttle manned career, people are paying more attention

22、on weightlessness osteoporosis in astronauts. Nowadays, common countermeasures cannot effectively relieve the muscle atrophy and bone loss. Vibration is believed to be one of the most prospective methods to solve this pr

23、oblem. However, only vibration itself cannot meet our need. Recently, bone’s interstitial fluid flow (ISF) is believed to be very significant to nutrient supply and waste metabolism of bone t</p><p>　　Ten fe

24、male Sprague-Dawley (SD) rats were divided into five groups: tail-suspension (TS), control (CON), vibration (TSV), passive movement (TSP) and vibration coupling passive movement (TSVP) group. The variation of ISF is anal

25、yzed by the parameters of lacuna. The results show that: tail-suspension could reduce the ISF in tibia, increase the lacuna’s number but not area in ulna and cannot affect the parietal bone. Moreover, vibration coupling

26、passive movement shows a positive influence on the ISF</p><p>　　This study is to study the effects of vibration coupling passive movement on bone’s interstitial fluid flow in tail-suspension for further inve

27、stigations.</p><p>　　Key words：tail-suspension rat, vibration coupling passive movement, ISF, tracer</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 緒論1</b></p&

28、gt;<p>　　1.1 課題背景及目的1</p><p>　　1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀4</p><p>　　1.3 論文構(gòu)成及研究內(nèi)容5</p><p>　　1.3.1 大鼠尾吊5</p><p>　　1.3.2 脛骨micro-CT掃描6</p><p>　　1.3.3 尾靜脈注

29、射7</p><p>　　1.3.4 切片制備7</p><p>　　1.3.5 采集圖像與處理獲取參數(shù)8</p><p>　　1.4 課題研究方法10</p><p>　　2 實驗方案12</p><p>　　2.1 實驗材料12</p><p>　　2.1.1 實驗材

30、料12</p><p>　　2.1.2 實驗器材12</p><p>　　2.1.3 實驗儀器12</p><p>　　2.1.4 主要試劑12</p><p>　　2.1.5 溶液配置13</p><p>　　2.2 大鼠尾吊及局部振動耦合被動運動訓練實驗13</p><p&

31、gt;　　2.2.1 環(huán)境控制13</p><p>　　2.2.2 局部振動耦合被動運動訓練裝置的設(shè)計14</p><p>　　2.2.3 尾吊步驟15</p><p>　　2.2.4 TSV組、TSP組、TSVP組以及CON組大鼠的處理15</p><p>　　2.2.5 實驗期間的注意事項16</p>&

32、lt;p>　　2.3 脛骨micro-CT掃描與3D重建16</p><p>　　2.4 尾靜脈注射Reactive red溶液16</p><p>　　2.5 大鼠脛骨、尺骨以及頂骨的解剖分離18</p><p>　　2.6 切片制作18</p><p>　　2.7 激光共聚焦顯微鏡圖像采集19</p>

33、<p>　　2.7 參數(shù)測量21</p><p>　　3 實驗結(jié)果與討論分析22</p><p>　　3.1 脛骨22</p><p>　　3.1.1 micro-CT掃描結(jié)果22</p><p>　　3.1.2 共聚焦圖像對比骨陷窩個數(shù)22</p><p>　　3.1.3 骨陷窩個

34、數(shù)23</p><p>　　3.1.4 骨陷窩面積24</p><p>　　3.2 尺骨25</p><p>　　3.2.1 共聚焦圖像對比骨陷窩個數(shù)25</p><p>　　3.2.2 骨陷窩個數(shù)25</p><p>　　3.2.3 骨陷窩面積26</p><p>　　3

35、.3 頂骨27</p><p>　　3.3.1 共聚焦圖像對比骨陷窩個數(shù)27</p><p>　　3.3.2 骨陷窩個數(shù)27</p><p>　　3.3.3 骨陷窩面積28</p><p>　　3.4 實驗結(jié)果的討論分析29</p><p><b>　　結(jié)論31</b><

36、;/p><p><b>　　致謝32</b></p><p><b>　　參考文獻33</b></p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 課題背景及目的</p><p>　　骨質(zhì)疏松癥是婦女和老年人面臨的主要問題之一。

37、骨折是骨質(zhì)疏松癥的病癥之一，然而骨質(zhì)疏松癥更多地表現(xiàn)為骨量減少導致的骨折風險增大[1]。在世界范圍內(nèi)，骨質(zhì)疏松問題困擾著上億人的健康生活，無數(shù)患者在痛苦中等待有效的治愈方法，如何研究出一種切實有效又簡便易行的治療方法已成為當務(wù)之急。并且，隨著人類科技水平的迅猛發(fā)展以及地球資源的大量開發(fā)，如何搶占太空資源，將國家建成太空大國、太空強國已成為不可回避的大趨勢。我國載人航天事業(yè)已進入空間站計劃階段，計劃將在2020年左右建立自己的空間站；在2

38、030年前后實現(xiàn)載人登月，并建立月球基地；在2050年前后，載人飛行將從月球基地飛向更遠的行星，并具備載人登火星的能力。因此，航天員失重性骨質(zhì)疏松現(xiàn)象也越來越受到關(guān)注。在太空中的微重力下，航天員會出現(xiàn)心血管系統(tǒng)失調(diào)、骨質(zhì)疏松和鈣磷代謝失衡、肌肉功能下降和肌萎縮等一系列適應(yīng)性生理變化[2]。在太空環(huán)境中，由于微重力作用導致的骨負重減少、骨鈣流失，骨量丟失的速度將達到地球上的10倍，承重骨的骨礦物質(zhì)密度甚至每個月將減少1.0%-2.0%[3

39、]。為此，各國都采取了不同的對抗措施來解決微重力導致的骨丟失問題。但是，無論</p><p>　　針對“為什么現(xiàn)有運動不能有效對抗空間失重性骨質(zhì)疏松？”這一問題，我們課題組曾大膽假設(shè)：運動類型的實質(zhì)性轉(zhuǎn)變（主動運動在某種程度上轉(zhuǎn)變?yōu)楸粍舆\動）可能是造成目前空間運動鍛煉不能有效對抗失重性骨質(zhì)疏松的原因之一。那么，在空間采取什么措施才能提高被動運動對抗骨丟失的效果呢？</p><p>　　振動

40、近年來被認為是對抗骨質(zhì)疏松最有應(yīng)用前景的方法之一。振動應(yīng)用于對抗骨質(zhì)疏松是將振動形式的機械刺激，作用于人體骨骼骨細胞增長區(qū)，從而使骨細胞生長，骨量增加，對抗松質(zhì)骨流失。全身振動可以通過傳遞機械加速度到四肢骨與中軸骨而誘導骨量增加。通過目前已得出的研究進展，我們發(fā)現(xiàn)短期振動訓練已作為增強神經(jīng)肌肉性能的一種訓練方法被使用。相關(guān)文獻已經(jīng)證實全身振動可以增強女性膝屈肌的靈活性和力量，并提高“功能性”腿筋,四頭肌肌肉比率[4] 。與此同時，在針對

41、優(yōu)秀體操運動員的振動實驗中，振動組也表現(xiàn)出了更好的平衡感、靈活度，且下肢相比也更有爆發(fā)力[5] 。因此，我們有理由認為利用振動來對抗失重性骨質(zhì)疏松是非常有前景的。</p><p>　　然而，有研究發(fā)現(xiàn)全身振動可引起人體的不適以及損害外周血管，且全身振動的效果依賴于身體姿勢[6, 7]。加之，由空間飛行（宇航員）及脊髓損傷（常人）導致的骨丟失及肌肉萎縮等主要發(fā)生在下肢等承重部位。因此，采用針對下肢的局部振動應(yīng)比全身

42、振動更適合于這些人群。此外，在絕經(jīng)后婦女的振動與抗阻運動實驗中，振動耦合抗阻運動組表現(xiàn)出了更高的肌肉強度，即是說振動不僅放大了抗阻運動的效果，抗阻運動也促進了振動的訓練效果[8]。關(guān)于這方面，從相關(guān)研究中我們發(fā)現(xiàn)，單獨的振動不能增加最大等張收縮和力學性能，而與傳統(tǒng)抗阻訓練組合的振動訓練表現(xiàn)出了最大等張收縮和力學性能的增加[9]。在振動平臺上的競技類深蹲實驗中，我們也發(fā)現(xiàn)，振動平臺上的深蹲組與傳統(tǒng)深蹲訓練組相比，在最大肌力和爆發(fā)力方面表現(xiàn)

43、出了優(yōu)勢[10]。因此，我們有理由認為單純的振動訓練不能完成預(yù)期的對抗效果，而將之與其他形式的訓練相結(jié)合可能能表現(xiàn)出更令人滿意且更有優(yōu)勢的效果。另外，由于目前空間宇航員運動類型的轉(zhuǎn)換、下肢廢用及骨關(guān)節(jié)炎等病人不方便進行主動運動，采用局部振動耦合被動運動的方式來對抗骨丟失可能更適應(yīng)于此類人群，而且有關(guān)于局部振動及局部振動耦合被動</p><p>　　綜上所述，為了節(jié)約宇航員的運動時間，最大程度的提高空間的運動效果，

44、我們提出了局部振動耦合被動運動的訓練方式，希望可以在對抗微重力造成的骨丟失方面產(chǎn)生“1+1”大于“2”的效果。現(xiàn)在，各研究機構(gòu)普遍采用尾吊大鼠來模擬宇航員在太空微重力下的骨丟失狀況。針對這一情況，通過研究振動耦合被動運動對尾吊大鼠的影響來試圖闡明骨丟失的機制以及振動耦合被動運動對失重性骨丟失的對抗效果是有一定可行性的。</p><p>　　與此同時，我們也注意到，在微重力條件下骨組織產(chǎn)生的變化中，不同部位的骨骼受

45、到了不同程度的影響。依據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)，飛行4.5～6 月的“和平”號航天員頭部出現(xiàn)骨密度增高，而骨盆、下肢骨出現(xiàn)密度下降[11]。并且，也有實驗證明尾吊模擬失重的大鼠也出現(xiàn)了顱骨和下頜骨骨量增加，后肢骨骨丟失的現(xiàn)象。在微重力條件下航天員出現(xiàn)體液頭向分布，不同部位骨丟失狀況不同的現(xiàn)象[12]。這一現(xiàn)象用傳統(tǒng)的Wolff 定律無法解釋。Dillaman 提出的液流理論能較好解釋上述現(xiàn)象[13]。液流理論認為骨骼應(yīng)力適應(yīng)性的源動力是應(yīng)變梯度介導間

46、質(zhì)液體沿小管和骨細胞突起的流動。液流主要對骨進行營養(yǎng)的供給與廢物的排除，此外骨是一種孔隙結(jié)構(gòu)，以往研究發(fā)現(xiàn)外力引起的骨組織形變，其間隙液流流動阻力及剪切力，會間接作用于骨組織細胞使其發(fā)生適應(yīng)性改變。受流體剪切力刺激后的骨細胞通過與成骨細胞的間隙連接或釋放信號分子，能增強成骨細胞的活性。大鼠后肢懸吊時，體液頭向分布，頭部的骨間隙中液體增加，經(jīng)過后肢骨的液流減少。對尾吊小鼠骨液流變化的研究可能能為骨丟失的機制及對抗措施提供實驗依據(jù)。<

47、/p><p>　　骨是一種持續(xù)調(diào)節(jié)自身結(jié)構(gòu)來適應(yīng)其力學環(huán)境的生物學系統(tǒng)。力學信號對于其適應(yīng)過程是很重要的。有三種類型的骨細胞：成骨細胞、骨細胞、破骨細胞。普遍認為骨細胞是可以感受力學載荷的細胞。這些細胞被骨基質(zhì)包埋且通過由微管的小骨管定位的細長細胞過程相互連通。</p><p>　　雖然骨細胞被認為是力學信號的感受器，但是力學載荷是如何從骨組織轉(zhuǎn)換到這些細胞的仍然是未知的。一些研究認為骨細胞感

48、知了整個骨組織的張力。然而，這一觀點導致了一個基本的悖論：活體內(nèi)作用于整個骨的張力（如組織級張力）是遠小于（0.04%-0.3%）細胞培養(yǎng)中激活骨細胞信號傳導的張力（1-10%）[14]。</p><p>　　尤等人提出了一個新的張力放大過程和模型，以此來解釋力學載荷誘導的陷窩-微管系統(tǒng)中的液體流動，在日常身體活動下，可以產(chǎn)生至少比整個骨組織變形放大一個數(shù)量級的骨細胞過程變形。這個新的模型為矛盾提供了一個可信的解

49、釋，這個矛盾即激活骨細胞所需的更大的張力不能直接由骨基質(zhì)變形提供，否則將導致骨折的事實。這個模型假定三個基本成分的存在：1）填充了整個骨細胞胞體和細胞過程的細胞外周空間的骨有機質(zhì)，2）通過微管錨定和集中骨細胞過程的橫向成分，3）在細胞過程中對抗環(huán)周張力和彎曲變形的晶體結(jié)構(gòu)。當骨負重時，變形誘導的壓力梯度會導致陷窩-微管系統(tǒng)的細胞外周空間中的液體流動（骨液流）。胞外基質(zhì)上的液流傳送到骨細胞過程周圍的細胞外周空間，由此產(chǎn)生變形。因此產(chǎn)生的張

50、力由跨膜蛋白及鏈接分子傳至細胞過程及細胞骨架，并產(chǎn)生向外的環(huán)狀張力。骨細胞過程的肌動蛋白束主要對抗此環(huán)狀張力。這兩個力的平衡導致了細胞骨架的形變并產(chǎn)生了至少比組織張力大一個數(shù)量級的力[15]。骨可能不是對組織形變敏感，而是對骨液流導致的壓力產(chǎn)生電勢（SGP）敏感。由于骨細胞對電場敏感，所以其可能直接回應(yīng)SGP。并且，流體剪切力表現(xiàn)出對骨細胞的直接刺激，</p><p>　　1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀</p&g

51、t;<p>　　骨細胞間質(zhì)液流動（骨液流）被認為對營養(yǎng)物質(zhì)運輸和來自骨細胞的新陳代謝廢物的運輸有幫助[17]。為了更好地理解骨中的細胞間質(zhì)液運動，相關(guān)方法使用像普施安紅（300~400Da，直徑＜1nm），活性紅（1470Da，直徑~1nm），微過氧化物酶（1860Da，直徑~2nm），辣根過氧化物酶（40kDa，直徑~6nm），鐵蛋白（440kDa，直徑~12nm）等標記或示蹤劑，并且不同大小的葡聚糖（范圍從300Da到

52、2000kDa，直徑~1nm到60nm）被用來示意不同大小的分子是如何穿過骨中不同的多孔性[18,19,20,21,22,23,24,25]。</p><p>　　皮質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)有3個級別的孔隙度：血管孔隙度，陷窩-微管孔隙度，以及礦化基質(zhì)的膠原-磷灰石孔隙度。動物的血管孔隙度沒有二級細胞結(jié)構(gòu)，比如大鼠和小鼠，包括初級管和橫向管；這個孔隙度是三個骨孔隙度中最大的（20μm級[26]）。陷窩-微管孔隙度是由陷窩和微管

53、中的骨細胞周圍的空間形成的（100nm級[14]）。在微管中，細胞外周的纖維基質(zhì)的作用被認為是維持細胞進程在相應(yīng)的位置，將它們與微管壁相連接[27]，并且使它們免于折疊[14]。纖維基質(zhì)的間隔被認為大概為7~8nm，與內(nèi)皮細胞上的表面多糖-蛋白質(zhì)復合物相似，并且纖維基質(zhì)被認為其工作機制類似濾網(wǎng)，只允許小于孔直徑的分子通過。最后，最小的骨孔隙度是與在膠原纖維和礦物磷灰石微晶之間的空間相連的膠原-磷灰石孔隙度?？紤]到陷窩-微管系統(tǒng)的孔隙度，

54、本實驗使用直徑為1nm的Reactive red示蹤劑進行研究，由于其直徑小，可能進入到骨組織更小的空間內(nèi)，因此可以較好地了解骨細胞在體內(nèi)的骨代謝情況以及骨內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化情況。</p><p>　　在骨質(zhì)疏松的對抗方面，目前已有的研究措施有藥物治療[28, 29]，以期利用相關(guān)藥物作用達到提高激素水平和鈣攝取量的目的；物理治療、運動以及振動等，用以對肌骨系統(tǒng)提供力學刺激，以期減少太空微重力環(huán)境對骨的負性影響。其中

55、已應(yīng)用在太空飛行中只有運動和振動。運動可以對骨產(chǎn)生應(yīng)力，在運動過程中地面或運動器械等對骨產(chǎn)生的反作用力，表現(xiàn)在運動中可以為抗阻運動或沖擊性運動，另一種是運動中肌肉收縮對骨骼產(chǎn)生的拉力、壓力以及剪切力等。其中運動主要又分為主動運動和被動運動。除了運動對抗骨質(zhì)疏松外，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)振動能夠促進新骨形成，對抗松質(zhì)骨流失。振動應(yīng)用于對抗骨質(zhì)疏松是將振動形式的機械刺激，作用于人體骨骼骨細胞增長區(qū)，從而使骨細胞生長，骨量增加[30]，對抗松質(zhì)骨流失

56、。前蘇聯(lián)就曾對太空飛行長達5個月之久的航天員實施全身振動訓練，發(fā)現(xiàn)其骨密度得到較好的保持[31]。因此研究局部振動耦合被動運動對抗失重性骨丟失的效果是十分有前景的。</p><p>　　1.3 論文構(gòu)成及研究內(nèi)容</p><p>　　本實驗主要包括大鼠尾吊、脛骨Micro-CT掃描、大鼠尾靜脈注射、顱骨、脛骨及尺骨的解剖制備、硬組織切片制備、圖像采集和圖像參數(shù)的處理分析。</p&

57、gt;<p>　　1.3.1 大鼠尾吊</p><p>　　模型的選取直接關(guān)系到模擬空間微重力的相關(guān)實驗的效果，因此，模擬空間微重力的模型至少包括以下幾點：1）整個系統(tǒng)不應(yīng)使動物處于長期緊張狀態(tài)；2）模型的無負載狀態(tài)必須不麻痹或限制動物的正常動作，并確保動物具有重新加負載和從無負載狀態(tài)中恢復的能力；3）模型的肌萎縮、骨丟失等狀況應(yīng)當與空間飛行中發(fā)生的狀況相似；4）模型需要提供與空間飛行狀態(tài)相似的體

58、液頭向分布狀態(tài)；5）實驗動物對無負載狀態(tài)的生理反應(yīng)應(yīng)當與空間飛行相似 [32] 。只有滿足了以上條件的實驗?zāi)Ｐ筒拍芎侠淼啬M空間失重性骨丟失的影響并研究不同對抗措施的對抗效果。</p><p>　　本實驗選用的尾吊大鼠模擬空間微重力模型可以基本滿足以上條件。首先，由于大鼠正常情況下四肢都是負重的，尾吊大鼠模擬空間微重力模型可以保證大鼠的前肢方便地活動、取食、理毛，因此可以最低限度地減輕實驗動物的緊張，保持實驗動物

59、的健康。其次，尾吊大鼠模型產(chǎn)生的頭向姿勢可以產(chǎn)生一個向頭部的液體轉(zhuǎn)移，就如同人體頭部向下臥床實驗和空間飛行中一樣，在整個實驗過程中都可以維持[33]。此外，研究表明下肢去負重的大鼠模型產(chǎn)生的骨的變化與空間飛行相似，模型動物與往返飛行的太空飛行動物的體重都與對照組相似[34]。最后，不同于早期的實驗研究采用全身束縛[35]或?qū)Υ笫蟊巢窟M行外科手術(shù)操作[36,37]來達到頭部向下的姿勢，雖然這些操作都可以達到后肢無負重的目的，但是這樣會使大

60、鼠在無負重狀態(tài)中產(chǎn)生壓力而影響實驗效果[38]。而本實驗采用的大鼠尾吊模型在經(jīng)過對其尾部的清潔處理、懸吊后可以基本滿足以上條件，是較為合適的模擬空間微重力的動物模型。</p><p>　　尾吊模型在利用大鼠和小鼠的研究類空間飛行變化中被廣泛使用。其中，大鼠尾吊無負重模型主要應(yīng)用于研究失重引起的肌骨、心血管系統(tǒng)以及生理代謝的變化[33]。因此，本實驗選擇SD（Sprague-Dawley）大鼠作為實驗?zāi)Ｐ汀８鶕?jù)相關(guān)

61、研究，我們發(fā)現(xiàn)成年雄性大鼠的骨垢端在30個月時仍沒有完全停止生長，這種不穩(wěn)定的狀態(tài)極有可能會對實驗結(jié)果造成影響，且多數(shù)文獻提出雄性大鼠作為模擬失重性骨丟失的模型并不合適[39]，因此本實驗選擇雌性SD大鼠建立模型。</p><p>　　為了最大程度減少大鼠的緊張并維持大鼠的身體健康，以下兩個環(huán)境和生理參數(shù)是很重要的。其一是住所，實驗動物的住所應(yīng)該位于獨立的房間中，且在實驗期間只有與實驗相關(guān)的人員可以進入飼養(yǎng)環(huán)境中

62、。其二是室溫，根據(jù)相關(guān)文獻，室溫在24.5到25.5℃之間是比較合適的[40]。與此同時，在生理方面也有兩點值得考慮。其一是體重，下肢去負重組與對照組的體重差異可以影響實驗結(jié)果。如果大鼠在24小時內(nèi)體重減少10%，那么其可能存在健康問題或生活環(huán)境的問題。如果2天后體重不能恢復的話，應(yīng)該將此樣本淘汰。其二是年齡，年幼大鼠與成年大鼠相比更容易適應(yīng)尾吊無負重狀態(tài)?？焖偕L大鼠（<200g）不應(yīng)該減少體重，即使與對照組相比其體重增長的較慢

63、。成年大鼠（>200g）可能減少體重或趨于穩(wěn)定[40]。</p><p>　　1.3.2 脛骨micro-CT掃描</p><p>　　骨密度BMD尤其是人體主要承重骨的骨密度與其極限應(yīng)力、極限能量、彈性模量呈線性正相關(guān)，通過測骨密度可初步預(yù)測其力學性能，因此被世界衛(wèi)生組織用來作為骨質(zhì)疏松的診斷標準。目前可以測量骨密度的設(shè)備有單能X線骨密度儀、雙能X線骨密度儀以及CT。</p

64、><p>　　DXA測量的骨密度BMD（單位：g/cm2）是面積密度，相對骨礦含量BMC（單位：g）數(shù)據(jù)更加穩(wěn)定同時可以反應(yīng)BMC的變化，所以一般最常用的指標就是BMD。與DXA測得的平面骨密度不同，Micro-CT由于X線管的旋轉(zhuǎn)和三維模型重建，測得骨密度為體密度也就是vBMD（Volumetric BMD），在保證掃描參數(shù)及感興趣區(qū)域相同的情況下，可以測得更精準的骨礦含量及密度。且Micro-CT對骨礦含量測量更

65、敏感，因此對于動物實驗而言，Micro-CT更加適合。因此，此次實驗本實驗組選擇micro-CT作為實驗設(shè)備檢測脛骨骨密度。</p><p>　　1.3.3 尾靜脈注射</p><p>　　大鼠尾靜脈注射技術(shù)是動物實驗中常用的藥物干預(yù)的方法之一，在本實驗中，熟練利用大鼠尾靜脈注射技術(shù)在大鼠尾部注射Reactive red分子示蹤劑是確保實驗順利進行的必要條件。根據(jù)相關(guān)文獻，大鼠尾靜脈有4

66、根，分別位于尾部左右兩側(cè)和背腹部。由于左右兩側(cè)與另兩根相比較淺且容易暴露，因此本實驗選擇左右兩側(cè)靜脈進行穿刺注射。大鼠尾部帶有的環(huán)狀表皮鱗可能會干擾到實驗操作，所以在進針前應(yīng)使用溫水（50℃-60℃）浸泡大鼠尾部，將尾部擦干后用醫(yī)用酒精擦洗，此時表面角質(zhì)層脫落且血管得到充分擴張，更易進針[41]。注射時一般選擇距尾尖1/4或1/3處，因為此處皮膚較薄且血管清晰，進針更容易。注射時將針頭與靜脈成15°角進針[42]，進針后針頭立

67、即與血管平行，輕輕回抽時有明顯回血，既可以開始推注了。正常情況下推注時無明顯阻力且血管不會鼓起，如遇沒有回血的情況，應(yīng)立刻拔出針頭重新穿刺，避免強行推注導致大鼠尾部皮下水腫。由于本實驗使用的是有顏色的分子示蹤劑，則應(yīng)該更加注意此操作。</p><p>　　1.3.4 切片制備</p><p>　　骨組織因為有骨鹽沉積的緣故，是較為堅硬的結(jié)締組織。制作骨切片的傳統(tǒng)方法流程包括脫鈣、脫水透明

68、、石蠟包埋以及切片，最后染色觀察。但是這一系列組織學處理過程可能會導致骨內(nèi)酶活性下降、骨組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并影響許多敏感指標的檢測甚至會嚴重影響后續(xù)觀察結(jié)果[43]。因此傳統(tǒng)的切片方法并不適合本實驗觀察骨液流使用，因此，本實驗使用硬組織切片技術(shù)。硬組織切片技術(shù)具有不破壞骨組織結(jié)構(gòu)和成分，在觀測過程中保證骨內(nèi)結(jié)構(gòu)及各成分不失真等優(yōu)點[44，45]。所以，硬組織切片技術(shù)對研究骨組織成分、骨形成和骨內(nèi)代謝有十分明顯的優(yōu)勢。</p>

69、<p>　　骨切片又可以分為脫鈣切片、不脫鈣切片和骨膜片。但是，這些方法都有各自的優(yōu)缺點，硬骨磨片不易影響骨內(nèi)酶水平及代謝情況，但磨片易破裂而不完整[46]；脫鈣切片需將標記染色的骨標本用脫鈣劑處理后再用冷凍劑或石蠟包埋，但這一系列復雜的組織學處理過程易使切片變形、失真，且石蠟包埋和冷凍處理的過程會造成本實驗示蹤分子的淬滅，因此硬骨磨片和脫鈣切片都不適合于本實驗對于骨液流的研究。不脫鈣切片可以完整地保存骨組織的礦化結(jié)構(gòu)，可

70、以測量包括骨小梁面積百分比（Tb.At）、數(shù)目（Tb.N）、間隙（Tb.Sp）、以及骨小梁周長（Tb.Pm）[47]等參數(shù)，更利于本實驗對于骨液流變化情況的觀察。</p><p>　　綜上所述，本實驗采用不脫鈣不包埋硬組織切片技術(shù)進行骨切片的制備，但是這種切片方法的缺點是由于骨組織較硬、切片方法不易掌握，因此，本實驗制備的脛骨、尺骨切片厚度只能達到100µm，由于頂骨較大且屬于扁骨、大鼠顱骨不規(guī)則等原因

71、，頂骨切片的厚度只能達到150µm。</p><p>　　此外，本實驗進行封片處理使用的封片劑是中性樹膠。中性樹膠具有透明度高、ph呈中性而不宜對玻璃造成腐蝕、其使用的溶劑二甲苯有殺霉菌作用可使切片可以長期保存等優(yōu)點。中性樹膠已廣泛作為生物切片的封藏試劑使用，操作簡單且價格便宜，因此本實驗使用二甲苯輔助中性樹膠作為封片處理的封片劑。</p><p>　　1.3.5 采集圖像與處

72、理獲取參數(shù)</p><p>　　本實驗選用激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察經(jīng)Reactive red染色后的脛骨、尺骨、頂骨切片，在調(diào)整好合適的位置和焦距后選擇所需區(qū)域拍照保存。</p><p>　　自二十世紀八十年代激光掃描共聚焦顯微鏡面世以來，由于其具有成像清晰、精確、客觀等優(yōu)勢，這種功能強大、使用便捷的顯微鏡已

73、經(jīng)越來越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學和生物學各方各面的研究當中。首先必須要強調(diào)的是，評價一臺顯微鏡性能優(yōu)劣的標準并不應(yīng)該只是其放大倍數(shù)，真正影響其成像清晰度和成像質(zhì)量的因素應(yīng)該是分辨力。分辨力一般用顯微鏡所能分辨清晰的最近的相鄰兩點之間的距離來衡量。顯微鏡的放大倍數(shù)即是正常人眼分辨力與顯微鏡分辨力的比值。但是，在實際應(yīng)用中，普通光學顯微鏡的分辨力會受到物理因素以及透鏡質(zhì)量的影響，包括球差和色差的影響。球差是指透鏡不能把近軸光線和遠軸光線在光軸上共聚

74、焦，導致點光線通過透鏡后無法匯聚而形成光斑，最后導致圖像模糊不清的現(xiàn)象。而色差是指顯微鏡針對不同顏色的光線折射率不同引起的不同顏色的光無法聚焦在一點而使圖像模糊的現(xiàn)象。與普通光學顯微鏡相比，激光掃描共聚焦顯微鏡具有以下特點[48]：1）用激光作光源。采用單色性更好的激光從根本上解決色差問題；2）利用共聚焦技術(shù)。利用物鏡焦平面前放置的中有小孔的擋板擋住雜散光，從根本上解決球差的問題，并輔助解決色差的問題；3）采用點掃描技術(shù)。不同于傳統(tǒng)的光

75、學</p><p>　　被譽為萬能顯微鏡的激光掃描共聚焦顯微鏡在功能上幾乎可以完全涵蓋日常實驗中使用的大多數(shù)光學顯微鏡。它兼具倒置光學顯微鏡、紫外線顯微鏡、熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡(PH)、微分干涉差顯微鏡(DIC)等常用顯微鏡的種種功能，其產(chǎn)生的圖像的精細程度又可以媲美甚至大大超過任何一種光學顯微鏡。因此，激光掃描共聚焦顯微鏡被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學的研究中。一臺裝置完備的激光掃描共聚焦顯微鏡應(yīng)包括以下

76、四部分：1）熒光顯微鏡光學系統(tǒng)：熒光顯微鏡作為激光掃描共聚焦顯微鏡的一個重要的組成部分，其主要是用于預(yù)覽樣品。通常熒光顯微鏡部分配備兩個光源—鹵素燈光源和汞燈光源。其鹵素燈光源用于尋找樣品焦平面、觀察樣品位置、形態(tài)和分布；其汞燈用于觀察和分辨樣品中產(chǎn)生熒光物質(zhì)的成分和位置。對于光敏（例如猝滅）的樣品最好用其光鏡進行預(yù)覽，以減少對樣品的刺激。2）掃描裝置：有可動反光鏡、分光器、pinhole及檢測器等重要部件。檢測器采用高靈敏度的光電倍增

77、管（Photo Multiplier Tube; PMT）其檢測的范圍和靈敏度可根據(jù)樣品的強度進行連續(xù)調(diào)節(jié)。將熒光圖像的強度按照0－255分級顯示。3）激光光源：常用的</p><p>　　本實驗采用激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像，可以保證圖像的清晰度和精準度。</p><p>　　在利用激光掃描共聚焦顯微鏡獲取所需圖像之后，本實驗使用ImageJ軟件進行圖像的處理以及相關(guān)參數(shù)的采集。Ima

78、geJ軟件具有以下特征：1）適用范圍廣泛。ImageJ是一款功能強大的基于java的公共圖像處理軟件，由National Institutes of Health開發(fā)?？蛇\行于Microsoft Windows，Mac OS，Mac OS X，Linux，和Sharp Zaurus PDA等多種平臺。能夠顯示，編輯，分析，處理，保存，打印8位，16位，32位的圖片， 支持TIFF, PNG, GIF, JPEG, BMP, DICOM,

79、 FITS等多種格式；2）軟件屬于開放資源。ImageJ軟件以及其java源代碼都是免費提供的和公共的，使用者不需要提供任何證書；3）插件豐富。通過使用ImageJ軟件的文字編輯器組合以及java編輯器中的拓展插件可以延伸ImageJ軟件的功能。ImageJ軟件共有超過500個插件可供使用；4）分析功能強大。ImageJ軟件可以測量面積、平均值、標準差、選取區(qū)域或整個區(qū)域的最大值和最小值等參數(shù)。測量長度和角度。可以使用現(xiàn)實中使用的計量單

80、位，如微米</p><p>　　1.4 課題研究方法</p><p>　　本實驗將以SD大鼠為研究對象，選取其脛骨中段、尺骨中段以及顱骨中的頂骨作為切片材料，使用硬組織切片機將其進行不包埋直接切片，利用激光掃描共聚焦顯微鏡采集陷窩圖像，并對圖像進行處理，得到相關(guān)參數(shù)后進行計算分析。</p><p>　　1）大鼠尾吊及振動耦合被動運動訓練</p>&l

81、t;p>　　本實驗將利用尾吊模型模擬失重環(huán)境，造成大鼠骨質(zhì)疏松。并在尾吊階段，按照實驗設(shè)計分組進行實驗，分設(shè)對照組、實驗組（包括尾吊組、尾吊+振動組（TSV）、尾吊+被動運動組（TSP）、尾吊+振動+被動運動組（TSVP））對大鼠進行實驗。</p><p>　　2）尾靜脈注射分子示蹤劑</p><p>　　在第一步實驗結(jié)束后，將大鼠麻醉，按照每100g體重1毫升的劑量，對大鼠尾靜脈注

82、射0.8%的Reactive red分子示蹤劑。</p><p><b>　　3）硬組織切片制備</b></p><p>　　在骨切片制備階段，選用不脫鈣不包埋骨切片作為本課題的研究對象。所得脛骨、尺骨以及頂骨直接使用硬組織切片機（EXAKT,CT300,Germany）將其切成約0.1mm、0.1mm、0.15mm厚的切片。</p><p>

83、<b>　　4）圖像采集</b></p><p>　　利用硬組織切片機切成的脛骨、尺骨、頂骨骨切片，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光分布情況。由于所使用骨切片橫截面積都較大，因此本實驗選取骨切片中較易辨認定位的區(qū)域（脛骨3個區(qū)域、尺骨2個區(qū)域、頂骨3個區(qū)域）分別進行觀察并獲取圖像。選取區(qū)域的具體位置如圖1.1。</p><p>　　5）參數(shù)的測量與計算分析</p

84、><p>　　圖像中骨陷窩、血管腔的面積、個數(shù)等相關(guān)參數(shù)可以通過本實驗選取的ImageJ圖像分析軟件分析測量，并將得到的數(shù)據(jù)用SPSS軟件處理，分析得出結(jié)論。</p><p>　　(a)脛骨切片橫截面選取的3個區(qū)域；（b）尺骨切片橫截面選取的2個區(qū)域；</p><p>　　（c）利用硬組織切片機制備的切片以及頂骨切片橫截面選取的3個區(qū)域.</p><

85、p>　　圖1.1 脛骨、尺骨、頂骨切片上選取的區(qū)域</p><p><b>　　2 實驗方案</b></p><p><b>　　2.1 實驗材料</b></p><p>　　2.1.1 實驗材料</p><p>　　實驗所使用的25只8周齡雌性SD大鼠購自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限

86、公司，大鼠于無菌環(huán)境生長，能保證身體健康狀況良好及大鼠間個體差異在實驗可以接受的范圍內(nèi)，因此較適合于本實驗。</p><p>　　2.1.2 實驗器材</p><p>　　燒杯、廣口瓶、鑷子、載玻片、蓋玻片、量筒、膠頭滴管、大鼠尾吊箱、鼠籠、5mL一次性注射器、4號針頭、醫(yī)用紙質(zhì)膠布、脫脂棉、紗布、透氣橡皮膏、手術(shù)剪、大鼠限動瓶、吹風機等。</p><p>　　2

87、.1.3 實驗儀器</p><p>　　BS系列電子天平（北京塞多利斯天平有限公司）</p><p>　　硬組織切片機（德國EXAKT，CT300）</p><p>　　激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica TCS SPE CTP6500）</p><p>　　micro-CT（比利時skyscan1076微型CT）</p>

88、<p>　　2.1.4 主要試劑</p><p>　　大鼠固體飼料（北京大學醫(yī)學部實驗動物中心）</p><p><b>　　松息酊</b></p><p><b>　　安息香酊</b></p><p><b>　　生理鹽水</b></p><p

89、>　　100%乙醇（北京化工廠）</p><p>　　中性樹膠（天津光復精細化工研究所）</p><p>　　二甲苯溶液（北京化工廠）</p><p>　　Reactive red（60%）粉末（美國Sigma公司）</p><p><b>　　1%戊巴比妥鈉溶液</b></p><p>&

90、lt;b>　　PBS磷酸緩沖液</b></p><p>　　2.1.5 溶液配置</p><p><b>　　1）生理鹽水</b></p><p>　　稱取0.9g氯化鈉，溶解于少量蒸餾水中，稀釋到100mL。</p><p>　　2）1%戊巴比妥鈉溶液</p><p>　　稱

91、取戊巴比妥鈉1g，溶解于100mL蒸餾水中。</p><p>　　3）PBS磷酸緩沖液</p><p>　　分別稱取0.2gKCl，0.2gKH2PO4，8.0gNaCl，0.84gNa2HPO4（或1.56gNa2HPO4·7H2O、2.08gNa2HPO4·12H2O），溶解于1L純水中將PH調(diào)至7.2~7.4，分裝后放入4℃冰箱內(nèi)保存。</p>&l

92、t;p>　　4）Reactive red溶液</p><p>　　稱取Reactive red粉末1.4g，溶解到100mLPBS磷酸鹽緩沖液中，避光保存。</p><p><b>　　5）松香酊</b></p><p>　　將20g松香置于300g酒精浸泡3天。</p><p><b>　　6）安息香酊

93、</b></p><p>　　將安息香400g研細，加入適合乙醇（30%），靜置過夜，再加入乙醇（30%）至100mL。</p><p>　　2.2 大鼠尾吊及局部振動耦合被動運動訓練實驗</p><p>　　2.2.1 環(huán)境控制</p><p>　　25只雌性SD大鼠，均為購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司的清潔級大鼠，實

94、驗開始當天按平均體重配對，標記采用電話按鍵式標記，即將大鼠腹部分為九個區(qū)域分別標記為1—9。例如：近右前肢側(cè)為1，腹中為5，近左后肢側(cè)為9，以此類推。頜下頸部為0。將標號后的大鼠隨機分為對照組、實驗組4組（包括尾吊組（TS）、尾吊+振動組（TSV）、尾吊+被動運動組（TSP）、尾吊+振動+被動運動組（TSVP）），每組各5只。大鼠平均體重為：CON組：192.4g；TS組：195.7g；TSV組：192.8g；TSP組：192.4g；T

95、SVP組：191.1g。</p><p>　　3周尾吊以及局部振動耦合被動運動訓練期間，給予充足的飲水和食物（鼠糧為北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供的標準大鼠飼料，其成分含量如下：粗蛋白：22.4%，粗脂肪：4.8%，粗灰分：6.78%，水分：10.6%，粗纖維：4.1%，鈣：1.18%，總磷：0.94%）；室溫保持在（25±2）℃，人工控制室內(nèi)照明，保持12h光照（8:00~20:00）和黑暗（20:0

96、0~次日8:00）交替循環(huán)。</p><p>　　2.2.2 局部振動耦合被動運動訓練裝置的設(shè)計</p><p>　　整個裝置主要由大鼠尾吊固定組件、大鼠振動/被動運動訓練組件和振動/被動運動控制組件三部分組成，如圖2.1。大鼠尾吊固定組件以大鼠固定盒和尾吊懸梁為主，分別用來固定大鼠軀干和實施尾吊；大鼠振動/被動運動訓練組件用來對尾吊大鼠實施被動耦合振動訓練；振動/被動運動控制組件對訓練

97、進行控制和量化。其中，訓練大鼠的后肢被固定在腿部限制板上，直流電機連接單列滾子偏心軸承通過單向旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生振動，通過偏心軸承的單向旋轉(zhuǎn)使小鼠腿部限制板產(chǎn)生振動，且可以通過控制偏心輪偏心距大小，控制振動的幅度；通過控制電子轉(zhuǎn)速，控制振動裝置的振動頻率。</p><p>　　本實驗選用的偏心軸承外徑（不包括滾子）為28mm，偏心距為0.5mm。偏心軸承每旋轉(zhuǎn)一圈就可以使運動軌跡限制板產(chǎn)生一次振動。另外由于運動軌跡限制板是

98、被兩顆限位柱加橡膠圈固定住，而且軸承外圍的滾子有一定的活動空隙，所以實際振幅是小于理論振幅的。另外目前公認能夠有效維持骨量的振動頻率在30Hz到90Hz之間，我們課題組已驗證在35、45、55Hz的振動頻率中，35Hz振動對抗骨質(zhì)疏松的效果最好，而有些文獻中提到，高頻振動可能引起骨裂，30Hz以上的振動對機體有明顯損傷，所以我們選擇30Hz的振動頻率，因此采用的直流電機最大轉(zhuǎn)速為1800r/min，當直流電機最大電流工作時產(chǎn)生的振動頻率

99、在30Hz左右，振幅小于0.5mm，加速度約為0.3g。</p><p>　　A：大鼠尾吊固定組件；B：大鼠振動/被動運動訓練組件；C：振動/被動運動控制組件.</p><p>　　圖2.1尾吊箱結(jié)構(gòu)圖</p><p>　　2.2.3 尾吊步驟</p><p>　　1）尾部皮膚表面準備：用大鼠限動瓶限制大鼠活動。第一步用肥皂水清洗尾部表面并

100、用吹風機吹干，之后依次向尾部表面噴涂安息香酊和松香酊，再次吹干，以防止粘貼物對皮膚的刺激作用，以上操作可以在一定程度上增大皮膚表面的粗糙度以防止尾吊膠布的滑脫。</p><p>　　2）大鼠尾部的粘貼固定：自一側(cè)尾根部起，按縱向走行，將一與尾部等寬的醫(yī)用膠布條，粘貼于尾部表面至距尾尖部3—5cm 處并留空一段膠布待用，接著，再將膠布條（不截斷）反向折回粘貼至大鼠尾根部。在此段尾部的表面，再依次間斷地橫向圍繞2—3

101、圈膠布條對縱行膠布條加強固定。將一小團脫脂棉固定于留空的膠布處，以防止膠布隨大鼠的活動擰在一起從而對大鼠尾部皮膚造成傷害。由于大鼠的嚙咬習慣，可能會咬壞醫(yī)用膠布，從而導致懸吊條件的消失而影響實驗結(jié)果，解決辦法是可以在尾根醫(yī)用膠布上涂抹芥末水或者有苦味的碘酒等。</p><p>　　3）大鼠尾部的懸吊：用長約10cm的膠布條將絞丁環(huán)與上一步驟中留空的膠布系在一起。再將絞丁環(huán)鉤在尾吊箱中鐵鏈的適當位置上，使大鼠的后爪

102、在伸直時剛好不能觸及籠的底層，從而使動物始終保持頭低位(約30度)</p><p>　　2.2.4 TSV組、TSP組、TSVP組以及CON組大鼠的處理</p><p>　　對照組（CON）的大鼠除了不尾吊外，其余條件與尾吊組（TS）相同，包括相同的環(huán)境，相同的喂養(yǎng)條件等。尾吊+振動組（TSV）、尾吊+被動運動組（TSP）、尾吊+振動+被動運動組（TSVP）的大鼠除與尾吊組（TS）在相同

103、環(huán)境下尾吊之外，每天上下午各根據(jù)分組利用局部振動耦合被動運動訓練裝置對各組大鼠分別進行一次訓練，訓練時長均為200s，振動頻率為30Hz，被動運動每10s一次。在實驗期間保證各組的基本生活環(huán)境，如室內(nèi)溫度、濕度等，喂養(yǎng)狀況相同，避免因外界不確定環(huán)境因素對實驗結(jié)果造成影響。</p><p>　　2.2.5 實驗期間的注意事項 </p><p>　　1）每7天左右需要更換一次粘在大鼠尾部的膠

104、布，同時更換粘貼部位。通過這一操作，原來粘貼部位可能出現(xiàn)的膠布刺激癥狀或皮膚的輕度損傷可以很快恢復，同時由于其尾部不斷長粗，經(jīng)常更換膠布條可以避免長時間懸吊時引起的尾部缺血性損傷。</p><p>　　2）在21天的實驗期間，每日觀察實驗大鼠的各項體征以確保其身體健康，主要包括以下幾方面：a）大鼠整體表現(xiàn)及活動情況；b）是否正常地進行喝水、進食；c）檢查尾部有無皮膚過敏、充血或壞死癥狀。一般情況下，尾吊鼠尾部的末

105、梢會出現(xiàn)輕微的應(yīng)激反應(yīng)，并無大礙。如果尾部有腫脹現(xiàn)象或者有壞死的皮膚，必須立刻更換膠布，并避開出現(xiàn)癥狀位置。另外，大鼠需要每天至少檢查兩次，保證沒有掉落。</p><p>　　2.3 脛骨micro-CT掃描與3D重建</p><p>　　在尾吊第0天和第22天，用1%的戊巴比妥鈉按照60mg/kg的劑量麻醉后，再確認大鼠已處于麻醉狀態(tài)，即無明顯動作且無動眼反射時，將大鼠腹側(cè)朝上用膠帶固

106、定于樣品床內(nèi)進行活體掃描。掃描設(shè)定參數(shù)為“70kV X線球管電壓，140μA電流，1mm鉛板過濾器，0.6°旋轉(zhuǎn)步進角度”，考慮到需要保證掃描圖像的質(zhì)量，本實驗中使用的活體掃描采用360°。掃描部位為脛骨近端。</p><p>　　掃描完成后，利用CTRecon軟件進行重建，重建參數(shù)為：Ring artifacts-8；Beam hardening-32%。之后利用重建得出的圖像進行相關(guān)參數(shù)的

107、計算，將計算結(jié)果通過SPSS統(tǒng)計分析軟件進行分析處理。</p><p>　　2.4 尾靜脈注射Reactive red溶液</p><p>　　尾靜脈注射Reactive red溶液的具體步驟如下：</p><p>　　1、大鼠的麻醉與固定。本實驗采用1%的戊巴比妥鈉作為麻醉劑對大鼠進行麻醉，麻醉劑用量為60mg/kg。實驗結(jié)束后大鼠的體重普遍在200g左右，故一

108、般注射0.8ml到1ml麻醉劑即可，由于本實驗選擇在micro-CT掃描后進行大鼠尾靜脈注射分子示蹤劑的操作，故如麻醉劑注射后五分鐘大鼠仍無明顯暈眩反應(yīng)，則可少量補充麻醉劑，最多不能超過0.3ml，以免造成大鼠死亡影響分子示蹤劑在體內(nèi)的循環(huán)。考慮到本實驗使用的Reactive red分子示蹤劑是有毒性的藥劑，因此應(yīng)盡可能減少麻醉劑的用量。如進行尾靜脈注射時大鼠仍留有部分意識，應(yīng)在助手的協(xié)助下在不壓迫血管的前提下固定大鼠。</p&g