食品科學與工程畢業(yè)論文酶解碎金槍魚肉的工藝研究

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　酶解碎金槍魚肉的工藝研究</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品科學與工程

2、 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></p>

3、;<p><b>　　摘 要1</b></p><p>　　ABSTRACT2</p><p><b>　　1前言3</b></p><p>　　1.1 金槍魚的研究概論 3</p><p>　　1.2 金槍魚營養(yǎng)價值4</p><p>　　1.3金

4、槍魚資源的開發(fā)現(xiàn)狀5</p><p>　　1.4 金槍魚下腳料綜合利用的研究進展...5</p><p>　　1.5蛋白質(zhì)水解度的測定方法6</p><p>　　2實驗材料、主要儀器與試劑6</p><p><b>　　2.1實驗材料6</b></p><p><b>　　2.

5、2主要儀器6</b></p><p><b>　　2.3主要試劑6</b></p><p><b>　　3實驗方法7</b></p><p><b>　　3.1分析方法7</b></p><p>　　3.2金槍魚下腳料酶解工藝流程7</p>

6、<p><b>　　4結(jié)果與分析7</b></p><p>　　4.1原料預處理7</p><p>　　4.2酶解最佳工藝的確定8</p><p><b>　　5小結(jié)12</b></p><p><b>　　參考文獻13</b></p><

7、;p><b>　　致謝15</b></p><p>　　附錄Ⅰ英文翻譯16</p><p>　　附錄Ⅱ英文原文22</p><p>　　[摘要]本文以金槍魚下腳料為原料，采用多種酶復合的方法，對碎金槍魚肉的酶解工藝進行研究，同時確定酶解碎金槍魚肉的最佳工藝。研究酶種的選擇、加酶量、溫度、pH和酶解時間對酶解的影響。得到結(jié)論：以水解度

8、為指標，篩選出水解金槍魚碎肉蛋白效果較好的兩種酶為胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。以這兩種酶組成雙酶反應體系，經(jīng)正交試驗得到金槍魚碎肉蛋白最佳水解條件為：反應溫度45℃、反應時間6h、胰蛋白酶添加量15000U/g、木瓜蛋白酶添加量為45000U/g、體系pH為7.0。在此條件下，金槍魚肉水解度可以達到15.83%。</p><p>　　[關鍵詞]金槍魚；蛋白酶；酶解</p><p>　　Study

9、 on Hydrolyzing of Tuna Meat Protein with Compound Proteases </p><p>　　[Abstract] In this paper, tuna scraps was prepared by the multiple enzymes composite methods of enzymatic hydrolysis of tuna meat resea

10、rch. Meanwhile determine enzyme solution the best technology of broken tuna meat. Study on the selection of enzymes, add enzyme content, temperature, pH, enzymatic hydrolysis time influence. Draw enzymolysing optimal pro

11、cessing parameters: Two enzymes as trypsin and papain were chosed because of their high degree of hydrolysis to tuna meat protein.In the two enz</p><p>　　[Key words] Tuna; Proteinase; Enzyme hydrolysis</p

12、><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　近年來，隨著世界人口的不斷增長，陸地資源的日益短缺和人類對海洋科學研究的深入，人類認識到了海洋資源對人類生存和發(fā)展的重要性，逐步開始增大了對海洋資源開發(fā)的規(guī)模和力度。但由于人類對海洋資源的過度利用，以及近年來全球氣候變暖的各項不利條件，造成了海洋資源的極度短缺，從而制約了海洋資源的發(fā)展。</p>&

13、lt;p>　　資源的短缺，使得人類開始投入一部分精力到海洋資源的綜合利用。使得海洋資源發(fā)揮出其最大的作用。我國金槍魚資源也是如此。中國大陸自20世紀80年代中期開始開發(fā)了遠洋金槍魚漁業(yè)。隨著捕撈漁船數(shù)量、捕撈技術(shù)設備和船隊管理水平等方面的了長足的進步，我國金槍魚產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)出欣欣向榮的景象。但從近幾年的數(shù)據(jù)來看，我國在太平洋，大西洋，印度洋等流域的捕撈量和捕撈種類呈逐年下降的趨勢。</p><p>　　我國的金

14、槍魚主要用于罐頭和生魚片產(chǎn)業(yè)，金槍魚屬于紅肉魚，從而造成了利用率不高的問題。而我國下腳料的利用方面處于落后狀態(tài)，基本用于魚粉加工，利用價值不高。而利用蛋白酶對魚肉進行水解，提取出水解蛋白，可以提高金槍魚的利用率和經(jīng)濟價值。本文研究的目的是通過以金槍魚下腳料為原料，經(jīng)過不斷地研究分析，獲得高附加值、高純度的魚制品，不但滿足消費者的新時代生活消費，而且為遠洋漁業(yè)和加工業(yè)的發(fā)展提供基本依據(jù)，以此擴大金槍魚的使用價值，進一步開闊金槍魚的市場空間

15、。</p><p>　　1.1 金槍魚的研究概論</p><p>　　金槍魚類，又叫鮪魚、吞拿魚，英文名為Tuna，是硬骨魚綱(Osteichthyes)鱸形目(Pereiformes)鯖科(Scombridae)魚類中具有胸甲(指胸區(qū)和側(cè)線前部明顯擴大的鱗片)幾個屬魚類的總稱[1]，從生物學的分類上講，廣義的金槍魚是指魚類中的鯖科、箭魚科和旗魚科共計約30種魚類，常見的金槍魚類有4個屬，

16、13個種，主要的經(jīng)濟種類包括藍鰭金槍魚(Thunnus thynnus)、馬蘇金槍魚(Thunnus maccoyii)、大眼金槍魚(Thunnus obesus)、黃鰭金槍魚(Thunnus albacares)、長鰭金槍魚(Thunnus alalunga)、鰹魚(Eleotridae)等6種。</p><p>　　金槍魚體呈紡錘形，具有魚雷體形，向后漸細尖而尾基細長，尾鰭叉狀或新月形，尾柄兩側(cè)有明顯的稜脊，

17、背、臀鰭后方各有一行小鰭，肩部有由擴大之鱗片組成的胸甲，體長最大可以達到4米，重800公斤。由于金槍魚的鰓肌已退化，因此必須不停地游動，使新鮮水流流過鰓部以獲取氧氣。金槍魚若停止游動，則會因缺氧窒息而死亡。為了適于快速游泳，金槍魚的鱗退化為小圓鱗，皮下密布血管網(wǎng)，肌肉中富含以血紅素為主的紅色蛋白質(zhì)，為金槍魚的持續(xù)游動供氧，一般時速為每小時30-50公里，最高時速可達每小時160公里。肌肉的收縮力量使它們體溫升高，比周圍水溫高出9℃。沿金

18、槍魚脊柱兩側(cè)強有力的肌肉和皮膚上大量的血管網(wǎng)叢表明它們有特別旺盛的新陳代謝能力，金槍魚的這種活動特點使其肉質(zhì)柔嫩鮮美，魚肉似紫紅色的牛肉，有很高的血紅素含量，低脂而高強蛋白，脂肪含量只有0.5%，而蛋白含量高達24.8%，背部肌肉呈紅色，稱為“赤身”，是制作生魚片和金槍魚罐頭的主要采集部位，腹部含有少量的脂肪。</p><p>　　金槍魚主要分布于低中緯度海區(qū)，如太平洋、大西洋和印度洋的熱帶、亞熱帶和溫帶廣闊水域

19、，為高度跨洋性的洄游魚類[2][3]。科學研究表明，大多數(shù)金槍魚生活在水深100~400米的海域，大眼金槍魚、黃鰭金槍魚和鰹魚的幼魚生活在海洋表層水域，一般不超過50米水深，而成魚棲息水層比較深。大西洋金槍魚超過總漁獲量10%的主要種類是黃鰭金槍魚(28%)、鰹魚(22%)、長鰭金槍魚(15%)、大眼金槍魚(11%)[4]。根據(jù)FAO（聯(lián)合國糧農(nóng)組織）統(tǒng)計，中西太平洋金槍魚漁獲量占世界金槍魚總產(chǎn)量的48%，主要包括鰹魚、黃鰭金槍魚、大目

20、金槍魚、長鰭金槍魚四種[5]。東太平洋的主要金槍魚種類包括大眼金槍魚、黃鰭金槍魚、鰹魚、長鰭金槍魚和藍鰭金槍魚五種，其中以黃鰭金槍魚最多，其次為鰹魚，再次為大眼金槍魚[6]。印度洋是全球金槍魚漁業(yè)的重要捕撈區(qū)域之一，近年來印度洋主要金槍魚種（包括大眼金槍魚，黃鰭金槍魚，長鰭金槍魚和鰹魚）年平均漁獲量超百萬噸，占全球金槍魚總產(chǎn)量的四分之一以上[7]。</p><p>　　1.2 金槍魚營養(yǎng)價值</p>

21、<p>　　金槍魚作為一種深海魚類，素來以營養(yǎng)價值高、純天然、無污染而享譽國際市場并有“海洋黃金”、“海底雞”的美稱[8~9]。下表為金槍魚與其他魚肉類營養(yǎng)成分的比較[10]，從表1可以看出，金槍魚的DHA、EPA含量遠高于其他六種魚類，每100g魚肉的脂肪酸含量高達20.12%；表2顯示，金槍魚肉與人們通常食用的牛肉、雞肉、豬肉相比，除了自身特有的成分之外，其熱量和脂肪含量均低于其他肉類，而蛋白質(zhì)含量高居首位，鐵含量僅次于

22、牛肉，維生素E的含量是僅次于它的肌肉的12倍多，營養(yǎng)價值顯著。</p><p>　　表1 主要食用魚類脂肪酸含量（以100g計）</p><p>　　表2 金槍魚與日常食用肉類營養(yǎng)成分比較（以100g計）</p><p>　　現(xiàn)代研究已經(jīng)證實，金槍魚對人體具有多種營養(yǎng)功效：（1）金槍魚低脂、低熱量、高蛋白，生物價高達90[11]，是現(xiàn)代女性輕松減肥的理想選擇。（2）

23、金槍魚中的DHA、EPA含量居各種食物之首。其中，DHA是大腦神經(jīng)和視神經(jīng)不可缺少的組成物質(zhì)，能促進青少年的大腦發(fā)育、改善記憶力、提高學習能力和預防老年癡呆癥，有益婦女的瘦身美容，還能補充婦女妊娠期的營養(yǎng)。而EPA則可以降低血脂，減少血液中的惡性膽固醇，增加良性膽固醇, 疏通血管，有效防止動脈硬化和膽固醇含量高所引起的疾病。此外，DHA和EPA還有助于肝細胞的再生，幫助保護肝細胞，降低肝臟疾病的發(fā)病率。（3）經(jīng)常食用金槍魚可以清除體內(nèi)多

24、余的鹽分，平衡體內(nèi)水分含量，保持標準的水分指標。（4）金槍魚血液中含有豐富的鐵和維生素B12等，易被人體吸收，經(jīng)常食用，可預防貧血，還可以作為貧血的輔助治療食品。（5）金槍魚富含蛋氨酸、胱氨酸等人體必需的8種蛋白質(zhì)氨基酸和?；撬幔谷藗冊谙碛妹朗车耐瑫r，還可以通過非藥物手段補充氨基酸成分。?；撬釀t可以抑制交感神經(jīng)興奮，降低血壓和膽固醇，防止動脈硬化，促進胰島素的分泌，提高肝臟的排毒作用。</p><p>　　1.

25、3 金槍魚資源的開發(fā)現(xiàn)狀</p><p>　　金槍魚類總產(chǎn)量比較穩(wěn)定，其中太平洋和印度洋的產(chǎn)量穩(wěn)中有升。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，2004年，世界大洋性漁業(yè)總產(chǎn)量為850萬噸，而金槍魚產(chǎn)量超過600萬噸，占公海漁業(yè)總產(chǎn)量70%以上，是世界遠洋漁業(yè)重要的捕撈魚類之一[12]。金槍魚漁獲量占世界總漁獲量4%左右，但貿(mào)易額卻占世界水產(chǎn)品貿(mào)易額10%以上，其中鮮、冷凍金槍魚占7%、罐頭金槍魚占3%。金槍魚漁業(yè)，是當前世界遠洋

26、漁業(yè)的典型代表，在遠洋漁業(yè)中占據(jù)舉足輕重的地位。</p><p>　　藍鰭金槍魚、馬蘇金槍魚、大眼金槍魚、黃鰭金槍魚因其營養(yǎng)價值較高，常被作為生魚片的原料魚，而素有“金槍魚之王”的藍鰭金槍魚更是生魚片的上選原料[13]。長鰭金槍魚和鰹魚主要用來做金槍魚罐頭原料，但是，最近也用長鰭金槍魚來做生魚片。黃鰭金槍魚、大眼金槍魚、長鰭金槍魚為延繩釣的主捕對象，鰹魚為桿釣的主要對象。</p><p>

27、　　目前，世界上有70多個國家和地區(qū)從事金槍魚的捕撈生產(chǎn)，主要有日本、中國臺灣省、韓國、美國、菲律賓、西班牙和印度尼西亞等，其產(chǎn)量約占世界金槍魚總產(chǎn)量的70%。近年來，世界主要經(jīng)濟種類的金槍魚年產(chǎn)量維持在350~400萬噸水平，產(chǎn)值達300億美元之多[14]。</p><p>　　1.4 金槍魚下腳料綜合利用的研究進展</p><p>　　隨著金槍魚加工業(yè)的發(fā)展，金槍魚功能食品的開發(fā)也逐漸

28、興起，這主要是因為金槍魚的主要加工部位為魚肉，產(chǎn)品以生魚片和金槍魚罐頭為主，而對于魚頭、魚皮、魚骨、內(nèi)臟和碎肉等，則作為下腳料處理。而這些下腳料大約占總重量的50~70%。研究表明，金槍魚頭眼窩中DHA的含量高達30%~40%，而EPA含量在5%~10%左右，是典型的“DHA高含量油”[15]。國內(nèi)有學者采用蛋白酶解法從黃鰭金槍魚眼窩中提取魚油，最終使魚油中DHA、EPA含量分別達到23.63%和4.84%，不飽和脂肪酸總含量達到38.

29、47%[16]。Jin-Wook Woo等[17]采用響應面法優(yōu)化了從黃鰭金槍魚背部皮膚中提取膠原蛋白的工藝，膠原蛋白的濃度最高可以達到27.1%。膠原蛋白在皮革、化妝品、食品、膜工業(yè)、制藥業(yè)、生物醫(yī)學材料等方面應用廣泛。Jae-Young Je等[18]考察了堿性蛋白酶、凝乳蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶水解金槍魚脊椎骨蛋白制備抗氧化活性肽的情況，其中中性蛋白酶的水解率最高，但胃蛋白酶的水解產(chǎn)物的清除自由基能力優(yōu)于

30、其他幾種蛋白酶的水解產(chǎn)物，經(jīng)色譜和質(zhì)譜分離出的抗氧化活性肽對脂肪的氧化</p><p>　　1.5蛋白質(zhì)水解度的測定方法[21]</p><p>　　蛋白酶對蛋白質(zhì)的酶解作用是通過水解肽鍵實現(xiàn)的。衡量蛋白酶的水解效果或蛋白質(zhì)的水解程度的一個重要指標是水解度（Degree of hydrolysis, DH）代表蛋白質(zhì)在水解過程中，肽鍵被裂解的程度或百分比。國內(nèi)外，測定水解度的方法很多，主要

31、包括pH- state法[22]、三硝基苯磺酸（Trinitrobenzenesulfonic Acid, TNBS）法[23-25]、鄰苯二甲醛（Ortho-phthalaldehyde, OPA）法[24]、水合茚三酮（ninhydrin）法[25]、甲醛滴定法[26]，此外，還有凝固點降低法和水溶性蛋白質(zhì)的測定法。</p><p>　　2 實驗材料、主要儀器與試劑</p><p>&

32、lt;b>　　2.1 實驗材料</b></p><p>　　金槍魚碎肉，由浙江省遠洋漁業(yè)集團公司寧波豐盛食品有限公司提供。</p><p><b>　　2.2 主要儀器</b></p><p>　　名稱 型號 廠家</p><

33、p>　　均質(zhì)器 JZ-Ⅱ型 鐵道部電化院四方電器設備廠</p><p>　　電熱恒溫水箱表 CU420型 上海益恒實驗儀器有限公司</p><p>　　電腦微波催化合成/萃取儀 XH-100A型 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司</p><p>　　電熱恒溫

34、鼓風干燥箱 HHG-9008型 上?；厶﹥x器制造有限公司</p><p>　　半微量定氮蒸餾器 SY.50-BWL型 北京卓川電子科技有限公司</p><p>　　定氮消化爐 KDN-04型 上海嘉定糧油儀器有限公司</p><p>　　精密酸度計

35、 PHS-3C型 上海精密科學儀器有限公司</p><p>　　恒溫磁力攪拌器 JB-2 上海雷磁新涇儀器有限公司</p><p>　　高溫鼓風干燥箱 HHG-9008型 上?；厶﹥x器制造有限公司</p><p>　　精密電子天平 BSA 12

36、4S型 Sartorius 公司</p><p>　　低速冷凍離心機 CR21G 型 日本日立公司</p><p>　　恒溫水浴鍋 HH-8 江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠</p><p><b>　　2.3 主要試劑</b></p>

37、<p>　　名稱 規(guī)格 廠家</p><p>　　氫氧化鈉 分析純A.R 南京化學試劑有限公司</p><p>　　次甲基藍 分析純A.R 國藥集團化學試劑有限公司</p><p&

38、gt;　　溴甲酚綠 Ind 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　無水乙醇 分析純A.R 國藥集團化學試劑有限公司 </p><p>　　甲基紅 分析純A.R 國藥集團化學試劑有限公司 </p><

39、;p>　　硫酸鉀 分析純A.R 國藥集團化學試劑有限公司 </p><p>　　濃硫酸 分析純A.R 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　硫酸銅 分析純A.R 國藥集團化學試劑有限公司</p><

40、;p>　　硼酸 分析純A.R 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　異丙醇 分析純A.R 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　酚酞 Ind 國藥集團化學試劑有限公司</p>

41、<p>　　胰蛋白酶 250萬U/g 國藥集團化學試劑有限公司 </p><p>　　木瓜蛋白酶 80萬U/g 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　中性蛋白酶 80萬U/g

42、 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　堿性蛋白酶 20萬U/g 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　甲醛溶液 分析純A.R 國藥集團化學試劑有限公司</p><p>　　濃鹽酸 分析純A.R 南

43、京化學試劑有限公司</p><p>　　百里酚酞 分析純A.R 國藥集團化學試劑有限公司</p><p><b>　　3 實驗方法</b></p><p><b>　　3.1 分析方法</b></p><p>　　3.1.1 蛋白質(zhì)含量的測定[27,

44、28]：微量凱氏定氮法</p><p>　　X= [C×（V1-V2）×14.01×F/w×1000]×100%</p><p>　　C：鹽酸標準液的濃度（mol/L） V1：滴定樣品消耗的鹽酸量（mL） V2：滴定空白消耗的鹽酸量（mL） 14.01：氮的摩爾質(zhì)量 F：氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù) w：樣品的質(zhì)量（g） X：蛋白質(zhì)含量（%）

45、</p><p>　　3.1.2水解度測定</p><p>　　DH (%) =n×100%/N</p><p>　　n：水解的肽鍵數(shù)（mol·g-1） N：總肽鍵數(shù)（mol·g-1）</p><p>　　3.2 金槍魚下腳料酶解工藝流程</p><p>　　原料蛋白（金槍魚加工下腳料）→

46、預處理→酶解→滅酶→分離→水解度測定</p><p><b>　　4結(jié)果與分析</b></p><p><b>　　4.1 原料預處理</b></p><p>　　4.1.1原料預處理方法：</p><p>　?。?）直接烘干：將金槍魚碎肉50g解凍，加水100mL，置于均質(zhì)器中，12000rpm攪

47、拌，制成勻漿，于105℃烘干至粉狀。</p><p>　　（2）脫脂干燥：將金槍魚碎肉50g解凍，加水100mL，置于均質(zhì)器中，12000rpm攪拌，制成勻漿。向勻漿中添加等體積的異丙醇，于50℃下脫脂1.5h。脫脂后的魚肉經(jīng)真空抽濾去除異丙醇后，于105℃烘干至粉狀。</p><p>　?。?）脫脂干燥后微波處理：將金槍魚碎肉50g解凍、經(jīng)脫脂干燥成粉狀，設定微波萃取儀功率為500W，溫

48、度50℃，對魚肉干粉進行微波處理10min。</p><p><b>　　4.1.2結(jié)果</b></p><p>　　分別各取一份按4.1.1的方法處理過的魚肉干粉15g，均按1:3的質(zhì)量比加水制成勻漿液。向三份勻漿液中按15000U/g的用量添加胰蛋白酶，于pH7.5、45℃下水解6h，結(jié)果如表3所示。</p><p>　　表3 不同預處理方

49、式對水解率的影響</p><p>　　原料蛋白不經(jīng)脫脂和微波預處理時，其水解率很低（3.71%）。對原料進行脫脂處理后，水解率提高了79.78%；進一步對脫脂魚肉蛋白進行微波處理，最終水解率提高到原來的2.4倍。這是因為魚肉脂肪與魚肉蛋白結(jié)合較緊密，胰蛋白酶的最佳水解位點被脂肪遮掩，影響了蛋白酶水解能力的發(fā)揮，經(jīng)異丙醇處理后，脂肪層被溶解，暴露了蛋白質(zhì)的水解位點，使水解率提高；而微波可以破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使蛋

50、白質(zhì)分子由蜷曲狀態(tài)變?yōu)槭嬲?，利于蛋白質(zhì)的水解。因此，本實驗確定先對原料進行脫脂和微波處理后，再進行后續(xù)操作。</p><p>　　4.2 酶解最佳工藝的確定</p><p>　　以水解度（DH）為考察指標，從胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶中篩選出兩種水解度最大的酶作為水解用酶，考察酶添加量、酶解溫度、pH、酶解反應時間對酶解效果的影響，同時對兩種酶的添加方式對水解效果的影響進

51、行研究。在此基礎上，采用正交試驗確定最優(yōu)化的酶解條件。</p><p>　　4.2.1酶種的選擇取</p><p>　　四份經(jīng)預處理后的魚肉干粉各15g，均按1:3的質(zhì)量比加水制成勻漿液100mL，分別用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶水解6小時，酶用量均為15000U/g，pH和溫度為各商品酶的最適條件。酶解液采用加熱滅酶法，即將酶解液置于水浴中加熱處理10min。為使滅酶充

52、分，加熱過程中可以適當振蕩。滅酶結(jié)束后，進行真空抽濾，收集濾液，測定被水解的肽鍵數(shù)，計算魚肉蛋白的水解度，結(jié)果如表4所示。</p><p>　　表4 不同蛋白酶酶解效果比較</p><p>　　由表4可知，在加酶量相同的條件下，四種蛋白酶的水解效果按由強到弱的順序排列為：胰蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>堿性蛋白酶。因此，選擇胰蛋白酶和木瓜蛋白酶作為雙酶水解用酶，并對影響

53、水解效果的因子進行考察。</p><p>　　4.2.2單因素實驗</p><p>　　4.2.2.1酶添加量對水解效果的影響</p><p>　　分別用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶對魚肉干粉進行單酶水解，底物濃度即魚肉干粉與水質(zhì)量比為1:3，控制反應溫度為50℃、反應體系pH在7.0，加酶量依次為5000U/g、10000U/g、15000U/g、20000U/g、250

54、00U/g，反應時間為6h。測定被水解的肽鍵數(shù)，計算出魚肉蛋白的水解度，結(jié)果如圖1所示。</p><p>　　圖1 加酶量對酶解效果的影響</p><p>　　從圖1可以看出，魚肉水解度隨著兩種酶用量的增加而增大，胰蛋白酶加酶量超過10000U/g時，水解度的增加變得緩慢，當加酶量達到20000U/g后，水解度幾乎不再增加；木瓜蛋白酶加酶量在5000U/g~15000U/g時，水解度隨酶量

55、的增加急劇增大，加酶量超過15000U/g后，水解度增加緩慢，加酶量在25000U/g時，水解度達到最大。從水解效果和生產(chǎn)成本兩個方面綜合考慮，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶水解金槍魚碎肉的最佳酶用量分別為20000U/g和25000U/g。</p><p>　　4.2.2.2溫度對水解效果的影響</p><p>　　分別用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶進行水解，酶添加量為20000U/g和25000U/g，

56、調(diào)節(jié)反應體系pH7.0、底物濃度為1:3，在不同的溫度下反應6h后，測定被水解的肽鍵數(shù)，計算出魚肉蛋白的水解度，結(jié)果如圖2所示。</p><p>　　圖2 反應溫度對酶解效果的影響 </p><p>　　酶促反應同大多數(shù)化學反應一樣，受溫度的影響較大。溫度低于酶促反應最適溫度時，酶活性隨溫度的升高而增大；溫度高于最適溫度時，蛋白酶開始變性失活。由上圖2可知，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶單獨作用時，

57、最適水解溫度分別為50℃和45℃。</p><p>　　4.2.2.3 pH對水解效果的影響</p><p>　　分別用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶進行水解，酶添加量為20000U/g和25000U/g，反應溫度分別為50℃和45℃，控制底物濃度為1:3，在不同pH的反應體系中反應6h后，測定被水解的肽鍵數(shù)，計算魚肉蛋白的水解度，結(jié)果如圖3所示。</p><p>　　圖3

58、反應體系pH對酶解效果的影響</p><p>　　蛋白酶是兩性分子，其空間結(jié)構(gòu)受酸堿的影響較大，導致蛋白酶作用位點的數(shù)目差異較大。只有在最適pH下，酶活性才能得到最大程度的發(fā)揮。由圖3可知，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的最適pH均為7.0。</p><p>　　4.2.2.4 時間對水解效果的影響</p><p>　　分別用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶進行水解，酶添加量為20000

59、U/g和25000U/g，反應溫度分別為50℃和45℃，控制底物濃度為1:3、反應體系pH7.0，在不同的水解時間測定被水解的肽鍵數(shù)，計算出魚肉蛋白的水解度，如圖4所示。</p><p>　　圖4 反應時間對酶解效果的影響</p><p>　　由圖4可知，隨著酶解作用時間的延長，魚肉蛋白的水解度逐漸升高，對于木瓜蛋白酶而言，酶解6h后，魚肉水解度趨于平穩(wěn)，而胰蛋白酶需處理8h方能達到最大水

60、解度，繼續(xù)延長反應時間，由于底物和加酶量一定，蛋白水解度將不再變化。因此，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶單獨作用時，酶解時間分別為6h和8h。</p><p>　　4.2.3雙酶添加順序?qū)λ庑Ч挠绊?lt;/p><p>　　雙酶水解的效果通常優(yōu)于單酶水解效果。為此，我們選擇木瓜蛋白酶和胰蛋白酶同時用于金槍魚碎肉的水解。表5反映了雙酶不同添加順序的水解效果，從中可以看出，兩種酶同時添加的水解效果最佳。

61、胰蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶，在胰蛋白酶的活性中心處有一個Asp，所以有利于結(jié)合正電性的Arg和Lys，作用位點在賴氨酸和精氨酸之間，水解由賴氨酸、精氨酸的羧基形成的肽鍵。木瓜蛋白酶屬于巰基蛋白酶 具有廣泛特異性。因此，魚肉蛋白質(zhì)經(jīng)非特異性的木瓜蛋白酶水解后，為胰蛋白酶提供了更多的作用位點，使水解程度大為改善。</p><p>　　由表6方差分析表[29]可知，加酶順序?qū)λ舛冉Y(jié)果影響顯著，在總的水解時間相同的條件下

62、，將兩種酶同時添加將得到較高的水解度，這可能是雙酶同時作用時產(chǎn)生了協(xié)同增效的效果，并且同時添加工藝更簡單，生產(chǎn)時間和成本可以降低。因此，我們采取同時添加胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的方式進行后續(xù)試驗。</p><p>　　表5 雙酶添加順序?qū)λ庑Ч挠绊?lt;/p><p><b>　　表6 方差分析表</b></p><p>　　F0.05 (1, 1

63、) =161.4</p><p>　　影響蛋白酶水解效果的因素主要包括反應溫度、pH、加酶量、反應時間，在單因素試驗的基礎上，進行了四因素三水平的正交試驗[30]，按正交表L9（34）安排實驗，表7為因素水平表，表8為正交試驗結(jié)果。</p><p>　　表7 雙酶酶解正交試驗因素水平表</p><p>　　表8 雙酶酶解正交試驗結(jié)果</p><p

64、>　　表9 正交試驗方差分析</p><p>　　注：F0.05（2,2）=19.0</p><p>　　由表8、表9可知，四個因素對水解度影響的主次順序為C（加酶量/U/g)>A（溫度/℃）>D（pH）>B（時間/h），通過方差分析可知，加酶量對水解度的影響顯著（p<0.05），而溫度、時間、pH對水解度影響不顯著（p>0.05）。最佳水解條件為A1B

65、3C3D2，即反應溫度為45℃、反應時間為6h、胰酶量為15000U/g、木瓜蛋白酶量為45000U/g、體系pH為7.0。在此條件下，金槍魚肉水解度可以達到15.83%。</p><p><b>　　5 討論</b></p><p>　　通過實驗，得到以下幾個結(jié)論：</p><p>　　1.原料預處理：以胰蛋白酶為水解用酶，以水解率為評價指標

66、，分別考察直接烘干、脫脂后烘干及先脫脂烘干再微波處理對魚肉蛋白水解的影響，結(jié)果表明：先將魚肉勻漿與異丙醇等體積混合，于50℃下脫脂1.5h后，烘干，再對脫脂魚肉粉進行功率為500W，溫度為50℃的微波處理10min，可以顯著改善金槍魚碎肉的水解率。</p><p>　　2.酶種篩選：以水解率為指標，分別考察了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶對碎魚肉的水解效果，最終確定胰蛋白酶和木瓜蛋白酶為試驗用酶。&

67、lt;/p><p>　　3.雙酶酶解參數(shù)的優(yōu)化：采用單因素法對雙酶各自的最適水解條件進行初步摸索，并確定同時添加兩種酶可以獲得較好的水解效果。在單因素的基礎上，進一步安排四因素三水平的正交試驗對蛋白酶添加量、酶解溫度、反應體系pH和酶解時間等進行優(yōu)化，確定最適水解條件為；反應溫度為45℃、反應時間為6h、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的添加量分別為15000U/g和45000U/g、體系pH7.0。在此條件下，水解度最高可達到

68、15.83%，接近單酶水解的2倍。</p><p>　　由于金槍魚漁業(yè)在我國起步較晚，國內(nèi)對金槍魚的加工水平還相對較低，捕撈產(chǎn)品主要還是以原條魚和初加工的產(chǎn)品形式輸往日本，其銷售額只占終產(chǎn)品銷售額很小的比重，因此單位產(chǎn)值相對偏低。加工過程產(chǎn)生的下腳料也只是被處理成廉價的飼料，而日本等發(fā)達國家已經(jīng)開始從金槍魚下腳料中開發(fā)出一系列具有保健和治療效果的高值化產(chǎn)品，如從金槍魚眼窩脂肪中富集高質(zhì)量的不飽和脂肪酸產(chǎn)品、酶解金

69、槍魚下腳料粗蛋白生產(chǎn)具有生理活性的降血壓肽、免疫肽多肽等肽類物質(zhì)也有研究、從金槍魚血塊和暗色肉中提取血紅素生物鐵制劑、從魚骨和魚刺以提取膠原蛋白等，這些技術(shù)既能提高金槍魚產(chǎn)品的附加值，又可以使資源得到充分的利用。</p><p>　　因此，本實驗通過對金槍魚肉酶解工藝的研究，為金槍魚的深加工開發(fā)提供參考，也為其他海洋魚類的精深加工提供示范和借鑒，以促進海洋水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。</p><p>&

70、lt;b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 羅殷,王錫昌,劉源.黃鰭金槍魚食用品質(zhì)的研究[J].食品科學,2008,29(9):476-480.</p><p>　　[2] 張青,王錫昌,劉源等.中國金槍魚漁業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].南方水產(chǎn),2009, 5(1):68-74</p><p>　　[3] 韓云峰.世界金槍魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展狀況

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85、p>　　[摘要]實驗以一種主要生活在里海的波斯鱘魚的內(nèi)臟物作為蛋白水解物的原材料。在三個不同溫度（35，45，55ºC）條件下水解，pH8.5，使用商業(yè)堿性蛋白酶，一個酶基底0.1AU/g，腑臟蛋白質(zhì)最短水解時間205分鐘。蛋白和脂肪水解產(chǎn)物分別為65.82%，0.18%。蛋白質(zhì)恢復和水解程度的范圍分別是34.97%～61.96%和13.32%～46.13%。最大水解程度是在205分鐘后55ºC(p <

86、0.05)。水解液的氨基酸評分與聯(lián)合國農(nóng)糧組織的參考蛋白相似。它顯示波斯鱘魚內(nèi)臟水解蛋白氨基酸滿足人類的需求。根據(jù)國家研究委員會指導方針、苯丙氨酸是海德魯-注射液的第一個限制氨基酸。然而,在作為原料進行制定飲食方面有潛在的應用。</p><p>　　[關鍵詞]酶解；鱘魚蛋白水解；水解條件；水解程度；蛋白質(zhì)恢復</p><p><b>　　1 前言</b></p&

87、gt;<p>　　大部分的這些副產(chǎn)品來自海產(chǎn)品加工，廢棄的植物沒有嘗試被回收利用。同時許多未處理的內(nèi)臟不再允許直接丟棄進入海洋，導致拋棄高成本的精煉材料。為滿足海鮮加工業(yè)的需要，應有選擇的投資將這些廢棄的副產(chǎn)物開發(fā)利用。</p><p>　　每年有超過132億噸的魚收獲，其29.5%被做成魚粉。大約超過50%的剩余的魚組織被認為是非食用性的廢棄物。隨著世界人口數(shù)量的顯著提高，全球每年的捕魚量超過10

88、0萬噸。顯然我們需要有更多的智慧和遠見增加海洋資源利用。應用酶技術(shù)對魚蛋白質(zhì)處理加工利用，可能生產(chǎn)出更多種類的食物或在工業(yè)產(chǎn)品的成分用途上更廣泛。這使得漁業(yè)副產(chǎn)品得到二次利用，除此之外，下腳料不會因此被丟棄。魚內(nèi)臟是其中最重要的副產(chǎn)物，富含蛋白質(zhì)和多不飽和脂肪，但是儲藏性能不好，需要冷凍保存。</p><p>　　選擇使用酶水解對蛋白質(zhì)的肽鍵改性被廣泛的應用于食品工業(yè)。在商業(yè)上使用最普遍的蛋白酶——用于魚蛋白水解

89、的來源如木瓜酶或從動物源性的如胃蛋白酶和胰酶。微生物酶同樣適用于魚蛋白質(zhì)水解，在比較動物或者植物源性酶時,微生物酶提供了一些有利條件，包括各種各樣的有效的催化活性及最適pH值和溫度穩(wěn)定性。一般來說，相較于中性或酸性酶，在適當?shù)膒H值條件下，可以在相對較短的時間內(nèi)達到高度的水解。</p><p>　　水解蛋白質(zhì)作為一種多肽可以改善腸道吸收，例如，因為成分性狀微生物的生長媒體。FPH魚肉蛋白水解這項工作日期有些零星，

90、魚肉蛋白水解液的優(yōu)良功能特性在大多數(shù)的研究探討動物飼料產(chǎn)業(yè)中得到應用。</p><p>　　南部海岸的里海鱘魚類最重要的是波斯鱘魚，用來做魚子醬且魚肉也得到利用，鱘魚加工過程中被丟棄的通常都是浪費，沒有得到任何的回收利用除了魚鰭。干燥或冷凍保藏的脊索用來傳統(tǒng)的熬湯補充營養(yǎng)。鱘魚內(nèi)臟含有豐富的蛋白質(zhì)，可以用作動物飼料,其蛋白質(zhì)可作為人們的食物成分。然而，目前還沒有報導關于研究酶水解鱘魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)的影響。研究時間和溫

91、度對水解鱘魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)影響的問題應得到關注和重視。</p><p><b>　　2.材料和方法</b></p><p><b>　　2.1.材料</b></p><p>　　波斯鱘魚從南部里海海岸的莎麗伊朗捕獲，立即轉(zhuǎn)移到實驗室，把取出的內(nèi)臟保存在-20 ºC條件下直至使用，水解內(nèi)臟在冰箱內(nèi)4±1

92、86;C中進行。</p><p><b>　　2.2.酶</b></p><p>　　堿性蛋白酶是從一個細菌胞內(nèi)蛋白酶應變的地衣芽孢桿菌。它是由伊朗的天津諾維信公司提供并保存在4ºC條件下直到使用。所有化學試劑用于實驗的分析純。</p><p>　　2.3.準備的魚水解蛋白</p><p>　　波斯鱘魚水解蛋白

93、生產(chǎn)解決方案在圖1給出。魚內(nèi)臟先在攪拌器內(nèi)破碎，然后在85ºC溫度下對酶進行20分鐘的滅活。加熱后的內(nèi)臟與磷酸鈉緩沖液1:4(w:v)在攪拌機內(nèi)均質(zhì)2分鐘?；旌衔锏乃釅A度最適宜堿性蛋白酶，pH8.5，加入0.2 N氫氧化鈉。堿性蛋白酶添加依據(jù)其酶活性0.1AU/g。所有進行的反應在250毫升玻璃器皿內(nèi)，在三個不同溫度35，45，55ºC下連續(xù)攪拌（轉(zhuǎn)速200r/min）。然后再在95ºC滅酶20分鐘。水解產(chǎn)

94、物在室溫下冷卻，在離心分離機中分離取上清液。</p><p>　　圖一.魚蛋白水解液酶法水解制備過程流程圖</p><p><b>　　2.4.化學成分</b></p><p>　　把含水率約為2g的樣品在鋁盤上稱重，然后在105ºC的烤箱中烘干至恒重。原材料的粗蛋白 (N × 6.25)確定使用凱氏定氮法，總脂質(zhì)的確定使用

95、索氏萃取，灰分的確定在600ºC的坩堝中灼燒直至呈白灰。</p><p>　　魚水解蛋白取離心后的上清液測量，以牛血清蛋白為一個蛋白質(zhì)的標準。在540nm波長范圍的紫外線/可見分光光度計中測量吸光度。美國格柏方法適用于估量水解產(chǎn)物的總脂含量。被計算利用的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物相對于水解初始蛋白質(zhì)多存在于反應混合物中。</p><p><b>　　2.5.程度水解</b&g

96、t;</p><p>　　水解程度的計算根據(jù)霍伊爾和梅里特方法。取上清液，加入的酸（三氯乙酸）為樣本體積的20%，再在10ºC，6700g離心20分鐘。收集10%的可溶性的三氯乙酸。水解度計算：</p><p>　　%DH=100 ×10%上清液中氨基氮量/樣品總氮量</p><p><b>　　2.6.氨基酸組成</b>&

97、lt;/p><p>　　準備的樣本在6M鹽酸，110ºC中水解12小時，使用苯基異硫氰酸鹽在高效液相色譜中分析?？偘被岷陀坞x氨基酸的分析采用微豆標簽的方法。使用微豆標簽欄(3.9 150毫米)，檢測每分鐘1毫升的流量。 Breez軟件適用于數(shù)據(jù)分析。</p><p><b>　　2.7.化學得分</b></p><p>　　化學得分即對

98、水解蛋白進行了數(shù)值計算，相對必需氨基酸脯氨酸的得分在檔案中參照聯(lián)合國糧農(nóng)組織所描述的標準蛋白質(zhì)?？傊没瘜W方法確定蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值的計算使用下面方程：化學得分=測試蛋白中的EAA(g 100g-1)/標準蛋白中的EAA(g 100g-1)</p><p>　　表1 緊鄰組成的鱘魚原料和蛋白質(zhì)水解液(FPH)。A</p><p>　　蛋白質(zhì) 脂肪

99、 水 分灰</p><p>　　魚內(nèi)臟 15.48 ± 0.25 15.68 ± 1.34 39 ± 00 5.76 ± 0.05</p><p>　　FPH 65.82 ± 7.02 0.18 ± 0.4 4.45 ± 0.67 7.67

100、± 1.24</p><p>　　A值代表±硒(n = 3)</p><p>　　2.8.計算蛋白質(zhì)的效率價值</p><p>　　波斯鱘魚水解蛋白質(zhì)效率的計算方法根據(jù)Alsmeyer,坎寧安,Happich和李·艾略特,RicKansrud和 Mugberg，經(jīng)Shahidi, Naczk, Pegg,Synowiecki 和Shah

101、idi et al的修改，這些方程在表4中給出了。</p><p>　　2.9.相對分子質(zhì)量分布</p><p>　　所有的樣品根據(jù)樣品緩沖液進行sds - page分析，使用4%疊加的凝膠和15%丙烯酰胺凝膠。蛋白質(zhì)樣本的濃度確定使用縮二脲方法。</p><p>　　電泳在冷水電泳系統(tǒng)中進行，使用的蛋白質(zhì)標準物從西格瑪奧德里奇采購。</p><

102、p><b>　　2.10.統(tǒng)計分析</b></p><p>　　獲得的數(shù)據(jù)受到諸多單因素影響，分析使用SPSS統(tǒng)計軟件，釋放12.0。鄧肯'新肯式多璧域法的履行確定在5%概率水平時有顯著差異。</p><p><b>　　結(jié)果和討論</b></p><p><b>　　3.1.緊鄰組成</b&

103、gt;</p><p>　　緊鄰組成的原材料和水解蛋白顯示在表1。水解液蛋白質(zhì)的最大含量65.82%，屬于63.4%～90.8%范圍內(nèi)。</p><p><b>　　時間（分鐘）</b></p><p>　　圖2.鱘魚內(nèi)臟蛋白水解物在堿性蛋白酶</p><p>　　溫度35ºC（▲），45ºC（█），

104、55ºC（◆）下的水解曲線</p><p>　　原料中的油脂含量相對較高，接近16%。但在本研究中大部分的油脂在離心時析出，還剩下0.18%。一些其他的研究者用發(fā)酵去除油脂，不溶物在FPH生產(chǎn)中的總油脂含量值0.5%。蛋白水解物油脂含量的減少可能大幅度增加材料的穩(wěn)定性對脂類物質(zhì)氧化而言，也有可能提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。</p><p>　　蛋白質(zhì)恢復程度范圍是40%～62%。蛋白質(zhì)恢復

105、進展增加明顯高于水解反應溫度較高時(表2)。在35ºC ，45ºC ，55ºC中水解的蛋白質(zhì)恢復程度分別是35% ～8%, 46% ～61% ， 56% ～62%。在不同溫度下，蛋白質(zhì)的恢復程度也顯著不同 (p < 0.05)。</p><p>　　3.2.時間和溫度對水解程度的影響</p><p>　　圖2顯示波斯鱘魚的水解程度隨水解時間增加而增加，水

106、解在55ºC，205分鐘后完成。水解率低于35ºC時的。用大西洋鮭魚和黃鰭金槍魚得到同樣的結(jié)果。Guerard et al推測降低反應速率可能是由于中間產(chǎn)物高程度的水解限制了酶活性。然而，水解率下降可能由于降低了肽鍵的濃度，酶失活或酶活性被抑制。</p><p>　　這項研究的結(jié)果顯示，水解度會隨水解溫度的升高而增大。觀察到的顯著差異是在于溫度。最大水解度在55ºC，205分鐘后到達

107、。溫度越高，水解度越大。他們發(fā)現(xiàn)毛鱗魚蛋白在65ºC，用堿性蛋白酶的水解度大約是22%，也觀察到水解度隨溫度升高而增大。</p><p>　　表2 鱘魚內(nèi)臟水解液蛋白質(zhì)在不同反應時間和溫度下的恢復。a、b</p><p>　　溫度(ºC) 水解時間(min)</p><p>　　30 60

108、 120 180 205</p><p>　　35 34.97 ± 0.56c 42.77 ± 1.08c 37.07 ± 0.96c 37.15 ± 0.57c 38.38 ± 0.15c</p><p>　　45 45.59 ±

109、 0.7b 48.02 ± 0.24b 54.53 ± 0.18b 48.96 ± 0.47b 60.51 ± 0.75b</p><p>　　55 56.37 ± 0.26a 58.29 ± 0.46a 59.14 ± 0.19a 60.42 ± 1.13a 61.96 ± 0

110、.20a</p><p>　　a值代表±硒(n = 3)</p><p>　　b在α= 0.05時，在同一列值不同上標有顯著差異</p><p>　　表3 波斯鱘魚內(nèi)臟水解蛋白的氨基酸組成(g 100 g-1)(55 ºC,205 min)和化學得分與聯(lián)合國糧農(nóng)組織的參考蛋白比較</p><p>　　氨基酸