暑期實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)分享

1、暑期實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)分享,中研院動(dòng)物所吳金洌老師實(shí)驗(yàn)室生科04891608彭柏欣,實(shí)驗(yàn)室研究方向介紹,1.魚(yú)類感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的研究 2.選殖出吳郭魚(yú)之類胰島素生長(zhǎng)因子 (IGF-I及IGF-II) 與生長(zhǎng)激素三種基因之cDNA序列，基因體結(jié)構(gòu)之分析，並利用E. coli表現(xiàn)出吳郭魚(yú)之IGF-I，IGF-II與GH的基因重組勝。選殖出斑馬魚(yú)與黑鯛I(yíng)GF-I cDNA序列與斑馬魚(yú)基因體結(jié)構(gòu)之分析並在酵母菌中表現(xiàn)黑鯛I(yíng)G

2、F-I的基因重組勝。3.研究鯉魚(yú)適應(yīng)環(huán)境溫度的調(diào)節(jié)機(jī)制,關(guān)於指導(dǎo)我的學(xué)長(zhǎng)—何國(guó)牟學(xué)長(zhǎng),1.做出四色螢光魚(yú) 2.利用螢光魚(yú)研究慢性肝炎3.圖片權(quán)屬於學(xué)長(zhǎng)，在此不附上，敬請(qǐng)見(jiàn)諒。,我的實(shí)驗(yàn)--毒性實(shí)驗(yàn),目的：想觀察不同化學(xué)物質(zhì)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎早期肝臟發(fā)育的影響，實(shí)驗(yàn)先使用野生型斑馬魚(yú)，分別以不同濃度之化學(xué)藥品處理其授精48小時(shí)胚胎，以期可以測(cè)出對(duì)斑馬魚(yú)胚胎造成一定傷害，但不會(huì)立即致死的特定濃度，再使用綠色螢光蛋白質(zhì)特定表現(xiàn)魚(yú)肝臟之基因

3、轉(zhuǎn)殖斑馬魚(yú)，藉由其肝臟有綠色螢光標(biāo)示，便於觀察其確實(shí)有無(wú)對(duì)肝臟造成損害，希望可以觀察到特定藥物對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生急性肝損傷的情況。,使用藥品,前後共計(jì)曾使用過(guò)DMSO、Alcohol、CCl4、carbamethapine、indomethacin(美灑辛) 、arsenic(砷) acid六種化學(xué)藥品，處理斑馬魚(yú)胚胎。分別以加入不同濃度藥品的曝氣水，飼養(yǎng)於塑膠六格盤(pán)。這六種藥物都被懷疑有輕重不一的肝毒性。,DMSO、Alcohol,使用

4、最高濃度4%，雖部分魚(yú)體外觀有畸形現(xiàn)象，但並未產(chǎn)生可能為肝損傷導(dǎo)致的明顯表徵，例如：水腫、疑似肝部位出血，故未進(jìn)行到使用轉(zhuǎn)基因魚(yú)實(shí)驗(yàn)部分。,CCl4,使用濃度：3λ(0.03%)、4λ(0.04%) 。對(duì)象：授精48小時(shí)斑馬魚(yú)胚胎。觀察：在持續(xù)藥物處理都出現(xiàn)嚴(yán)重的水腫，及程度不一的內(nèi)出血現(xiàn)象，但此損害現(xiàn)象非直接和化學(xué)藥品濃度成正比，在2λ處理組中，中毒現(xiàn)象並不明顯，且緩慢許多，在濃度2λ以下處理相同時(shí)間甚至看不出任何損傷。懷疑一定

5、濃度下CCl4可能腐蝕六格盤(pán)，溶解出未知有害物質(zhì)，在進(jìn)一步使用轉(zhuǎn)基因魚(yú)實(shí)驗(yàn)中，改用玻璃培養(yǎng)皿操作，一組為轉(zhuǎn)基因魚(yú)，使用3.5λCCl4處理，另一組為野生型，使用4λCCl4處理。,CCl4,4λCCl4組明顯水腫及死亡的進(jìn)展速度較3.5λ組快，相較於之前以六格盤(pán)同濃度組比較，中毒表徵及死亡速度進(jìn)展較不嚴(yán)重且較緩慢，故先前考慮之CCl4腐蝕六格盤(pán)並溶解出未知有害物質(zhì)，確有影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在以3.5λCCl4處理轉(zhuǎn)基因魚(yú)2天後，挑出肝臟有

6、發(fā)光之幼魚(yú)，原先以一般光學(xué)顯微鏡觀察有疑似中毒表徵（如水腫、軀體發(fā)育畸形）的個(gè)體，經(jīng)挑選後全部皆為不發(fā)螢光，剩下肝部有發(fā)螢光的個(gè)體，肝臟未出現(xiàn)明顯損傷且外觀正常。,CCl4,處理9天後以螢光顯微鏡觀察，肝部仍未出現(xiàn)明顯損傷，雖然其外觀已不健康有些水腫、出血，活動(dòng)力不佳，多平躺狀態(tài)，且死亡過(guò)半；可能因?yàn)槲催_(dá)CCl4造成急性肝損傷濃度，或因處理時(shí)間不夠長(zhǎng)，而魚(yú)已經(jīng)體弱無(wú)法順利進(jìn)食，飢餓而死。後經(jīng)林立元老師提醒，才知CCl4對(duì)部分塑膠 (P

7、C)有腐蝕性。,Carbamethapine、Indomethacin、Arsenic acid,使用濃度：0.25λ(25μM)、0.125λ(12.5μM)、0.0625λ(6.25μM)各兩盤(pán)。對(duì)象：授精48小時(shí)野生型斑馬魚(yú)胚胎。觀察：其中indomethacin表態(tài)不正常及死亡情況最為嚴(yán)重，其次為arsenic acid 、carbamethapine，以一般光學(xué)顯微鏡觀察可見(jiàn)其肝臟部位較未處理的魚(yú)不透明，有些腫大，推測(cè)可

8、能對(duì)肝臟造成傷害，故改使用轉(zhuǎn)基因魚(yú)。,Carbamethapine、Indomethacin、Arsenic acid,使用濃度：0.25λ的carbamethapine、indomethacin、arsenic acid。對(duì)象：轉(zhuǎn)基因螢光斑馬魚(yú)48pfd觀察：經(jīng)過(guò)加藥處理6天後，開(kāi)始出現(xiàn)死亡，14天後，以螢光顯微鏡觀察尚存活的小魚(yú)，其肝臟部分仍正常發(fā)光，無(wú)明顯的損傷。本次毒性實(shí)驗(yàn)螢光部分缺少持續(xù)拍照，及對(duì)照組的比較，紀(jì)錄不夠完整

9、、持續(xù)，我想這是這次毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)肝損傷無(wú)明顯發(fā)現(xiàn)的因素之一，是往後操作實(shí)驗(yàn)我應(yīng)注意的地方。,檢討,本次毒性實(shí)驗(yàn)螢光部分缺少持續(xù)拍照，及對(duì)照組的比較，紀(jì)錄不夠完整、持續(xù)，我想這是這次毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)肝損傷無(wú)明顯發(fā)現(xiàn)的因素之一，是往後操作實(shí)驗(yàn)我應(yīng)注意的地方。,實(shí)驗(yàn)中斷,進(jìn)入雜工生活?意外的收穫做些簡(jiǎn)單的分生實(shí)驗(yàn)，enzyme digestion ﹑ ligation ﹑ 藍(lán)白挑 ﹑mini-preparation等。,養(yǎng)魚(yú)度日,餵魚(yú)產(chǎn)卵換