細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)培訓(xùn)班講義

1、2007-9-10,Bitab,1,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)講 義,北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司2007年9月,2007-9-10,Bitab,2,目 錄,一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的基礎(chǔ)理論-------------3二、 BET試驗(yàn)前的準(zhǔn)備------------------------24三、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的實(shí)驗(yàn)技術(shù)-------------281，鱟試劑靈敏度復(fù)核------------------------

2、-332，干擾初篩試驗(yàn)------------------------------403，干擾試驗(yàn)------------------------------------494，檢查法---------------------------------------62四、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,2007-9-10,Bitab,3,一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的基礎(chǔ)理論,1，細(xì)菌內(nèi)毒素2，鱟試劑3，BET用水4，BET程序5，200

3、5年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法6，相關(guān)參數(shù)的計(jì)算7，試驗(yàn)的相關(guān)知識(shí),2007-9-10,Bitab,4,1、細(xì)菌內(nèi)毒素1）化學(xué)成分及特性 -- 革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物 -- 是高分子量脂多糖復(fù)合物（LPS） 除上述性質(zhì)外，LPS還有許多其他的生物活性,（1）特性,2007-9-10,Bitab,5,內(nèi)毒素的分子結(jié)構(gòu),,（2）化學(xué)結(jié)構(gòu) -- 含有

4、3個(gè)截然不同的區(qū)域,◆O- 特異側(cè)鏈◆核心多糖◆類脂A,2007-9-10,Bitab,6,2） 內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系 -- 內(nèi)毒素是熱原之一種-- 醫(yī)藥工業(yè)接受的觀點(diǎn)是，內(nèi)毒素是目前醫(yī)藥工業(yè)中最普遍和最主要的外源性熱原，控制內(nèi)毒素污染就等于控制熱原污染。3）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素和環(huán)境內(nèi)毒素1）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素經(jīng)人工提取精制并經(jīng)生物效價(jià)測(cè)定的細(xì)菌內(nèi)毒素，作為BET檢查的參考品或?qū)φ掌?。主要分參考?biāo)準(zhǔn)品（RSE）及工作標(biāo)準(zhǔn)品（CS

5、E）。CSE的效價(jià)必須用RSE來(lái)標(biāo)化。目前CSE的效價(jià)有兩種標(biāo)示方法：固定效價(jià)法（中國(guó)）及浮動(dòng)效價(jià)法（國(guó)際）。2）環(huán)境內(nèi)毒素天然產(chǎn)生的內(nèi)毒素，普遍存在于水、空氣及各種原料中，成分除了脂多糖外還含有較多的蛋白質(zhì)、多糖和其他雜質(zhì)，其極性不明顯，致熱性較標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素弱。BET的對(duì)象是環(huán)境內(nèi)毒素。,2007-9-10,Bitab,7,4）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液（C溶液）的制備1）中國(guó)藥典2005年版的BET法規(guī)定，將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)

6、毒素檢查用水溶解后，需在旋渦混合器上混勻15分鐘，以后每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘，其他國(guó)家藥典都有類似要求-- 具有極性的內(nèi)毒素分子在水中呈現(xiàn)不均勻分布,2007-9-10,Bitab,8,2、鱟試劑,1）鱟試劑的分類 -- 根據(jù)鱟的種類分類 美洲鱟試劑(LAL) 中國(guó)鱟試劑或東方鱟試劑（TAL） -- 根據(jù)檢查方法分類 凝膠法鱟試劑 光度法鱟試劑 -- 根據(jù)鱟試劑的反應(yīng)特異性分類

7、 普通鱟試劑 特異型鱟試劑,2007-9-10,Bitab,9,2）鱟試劑的規(guī)格 -- 一般分單次試驗(yàn)試劑和多次試驗(yàn)試劑（也稱大裝量試劑）-- 把自身的包裝容器作為反應(yīng)管的試劑稱為單次試驗(yàn)試劑，在國(guó)內(nèi)使用的0.1ml/支的鱟試劑就屬于單次試驗(yàn)試劑-- 多次試驗(yàn)試劑有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用時(shí)應(yīng)先用相應(yīng)量的溶解液復(fù)溶鱟試劑。,2007-9-10,Bitab,10,3）鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) -- 靈敏度

8、 定義：再細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定的條件下，能使鱟試劑產(chǎn)生凝集的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的最低濃度，單位EU/ml。 常用鱟試劑的靈敏度：0.5EU/ml、 0.25EU/ml、 0.125EU/ml、 0.06EU/ml、0.03EU/ml-- 自身凝集 部頒標(biāo)準(zhǔn)，鱟試劑的陰性對(duì)照在37度4小時(shí)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)-- 緩沖能力-- 干燥失重-- 無(wú)菌：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)無(wú)此項(xiàng)要求,2007-9-10,Bitab,11,4）鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)

9、理,C因子,活化的C因子,內(nèi)毒素,活化的B因子,B因子,,,凝固酶,凝固酶原,,,凝固蛋白（凝膠）,凝固蛋白原,,,,β葡聚糖或LAL-RM,活化的G因子,G因子,,,二價(jià)陽(yáng)離子,,,,AC-lle-Glu-Ala-Arg-pNA,（酶作用物）,AC-lle-Glu-Ala-Arg-OH,pNA,405nm測(cè)吸光度值,,,,,,（對(duì)硝基苯胺 黃色）,2007-9-10,Bitab,12,3、BET用水,2000年版藥典要

10、求，BET用水應(yīng)為與0.03EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑在37±1℃條件下24小時(shí)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的滅菌注射用水。2005年版藥典要求，凝膠法BET用水應(yīng)為內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水；光度測(cè)定法用的BET用水內(nèi)毒素含量應(yīng)少于0.005EU/ml。美國(guó)藥典要求的BET用水是指與所使用的鱟試劑不發(fā)生反應(yīng)的滅菌注射用水或其他水。,2007-9-10,Bitab,13,4、BET程序,1）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)z法

11、光度測(cè)定法2）檢查法 凝膠法光度測(cè)定法 動(dòng)態(tài)法 終點(diǎn)法：終點(diǎn)比色法試驗(yàn),,,,,靈敏度的復(fù)核試驗(yàn),干擾試驗(yàn),標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn),干擾試驗(yàn),凝膠限量試驗(yàn),凝膠半定量試驗(yàn),動(dòng)態(tài)比濁法試驗(yàn),動(dòng)態(tài)比色法試驗(yàn),動(dòng)態(tài)終點(diǎn)法,2007-9-10,Bitab,14,5、《中國(guó)藥典》2005年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法,1）綜述部分細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的定義及BET方

12、法學(xué)分類內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品及檢查用水BET器具的要求供試品溶液的要求內(nèi)毒素限值的確定最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算,2007-9-10,Bitab,15,2）試驗(yàn)部分,（1）凝膠法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)干擾試驗(yàn)檢查法（2）光度測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)干擾試驗(yàn)檢查法,3）2005年版藥典BET法際驗(yàn)部分主要內(nèi)容,,凝膠限量試驗(yàn),凝膠半定量試驗(yàn),2007-9-10,Bitab,16,2007-9-10,Bitab,17,1）內(nèi)毒素

13、限值 （1）藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：L=K/ML為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg(活性單位)表示；K為人每公斤體重每小時(shí)科接受的最大內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K=5 EU/(kg·h),放射性藥品注射劑K=2 EU/(kg·h),鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/(kg·h), M為人每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑

14、量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)、 U/(kg·h)表示，人均體重按60Kg計(jì)算，注射試劑若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。,6、相關(guān)參數(shù)的計(jì)算,2007-9-10,Bitab,18,（2）內(nèi)毒素限值計(jì)算舉例 -- 注射用的頭孢曲松鈉舒巴坦鈉，成人最大劑量為1500mg/次 L= =0.20EU/mg

15、 -- 注射用人頭孢孟多酯鈉，成人每日劑量為2.0至8.0g，分3至4次給藥，一日最高劑量不超過(guò)12g L= =0.075EU/mg -- 對(duì)于大輸液（LVP）,美國(guó)藥典（USP）通常都取L值為0.5EU/ml,,5 EU/(kg·h),1500 mg/(60kg·h),,5 EU/(kg·h),(12

16、000mg/3) / (60kg·h),2007-9-10,Bitab,19,2）最大有效稀釋倍數(shù) -- 供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）按以下公式計(jì)算 MVD=CL/λ C為供試品溶液的濃度，其中當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C為1.0ml/ml;當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí),C的單位為mg/ml或 U/ml。凝膠發(fā)中，λ為鱟試劑的靈敏度光度測(cè)定法中，λ為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度-- 如使用鱟試劑靈敏度為0.25

17、EU/ml，注射用頭孢曲松鈉舒巴鈉（濃度為10mg/ml,L=0.2EU/mg）的最大有效稀釋倍數(shù)為 MVD= =8 (倍),,10mg/ml x 0.2EU/mg,0.25EU/ml,2007-9-10,Bitab,20,3）最低有效稀釋濃度(MVC) -- MVC=λ/ L -- 如使用鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，注射用頭孢曲松鈉

18、舒巴鈉的最低有效濃度為 MVC= = 1.25mg/ml4) 樣品稀釋過(guò)程中加液量的計(jì)算 -- 稀釋過(guò)程中，假設(shè)從溶液S1?。▁）ml溶液稀釋（n）倍至S2，加液量為（y）,則滿足： y= (n-1) X x -- 如從溶液S1取0.5ml稀釋3.8倍至S2,則加液量為： y=(3.8-1) X 0.5=1.4ml 即0.5m

19、l的S1加1.4ml稀釋液即得S1的3.8倍稀釋液S2,,0.20EU/mg,0.25EU/ml,2007-9-10,Bitab,21,7、試驗(yàn)相關(guān)知識(shí),1) 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的使用（1）復(fù)溶 -- 復(fù)溶2ml安瓿裝的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，為了避免溶液再混合時(shí)溢出安瓿，我們建議在安瓿頸部上方開(kāi)口加液。復(fù)溶液的體積一般為1ml,或根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)加液。（2）效價(jià)-- 廠家必須向用戶提供一份效價(jià)分析證書(shū)（Certificate of Analy

20、sis,CoA）效價(jià)分析證書(shū)應(yīng)注明：RSE/CSE ____EU/mg; _____ng/瓶,2007-9-10,Bitab,22,2) 鱟試劑的使用 -- 使用前，應(yīng)將鱟試劑置于室溫環(huán)境下使其大道室溫溫度鱟再?gòu)?fù)溶使用 -- 復(fù)溶鱟試劑鱟，應(yīng)避免強(qiáng)烈振動(dòng)產(chǎn)生泡沫 -- 由于鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的不可逆性，反應(yīng)過(guò)程中必須避免反應(yīng)試管的振動(dòng)造成假陽(yáng)性3）內(nèi)毒素的清除（1） 沖洗適用于器械組件、塞子等可用于加熱等方法提高

21、清除效率（2）蒸餾，折流系統(tǒng)和地心引力阻止大分子量的LPS轉(zhuǎn)變?yōu)檎羝麪顟B(tài)逸出（3）反滲透 （4） 超濾 （5）活性炭吸附,2007-9-10,Bitab,23,4）內(nèi)毒素的滅活（1） 酸/堿水解（2）氧化 -- H2O2（3）干熱 -- 250℃，>30分鐘的干烤,2007-9-10,Bitab,24,二、BET試驗(yàn)前的準(zhǔn)備,1. 在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)中，凡是與試驗(yàn)樣品或試劑接觸的器具必須經(jīng)過(guò)除

22、熱原處理。玻璃器皿一般用洗液浸泡4小時(shí)后，用自來(lái)水沖洗，再用真餾水沖洗、晾干。最后在280℃干烤至少120分鐘。,2007-9-10,Bitab,25,2. 試驗(yàn)所試用的器具主要包括有：無(wú)熱原稀釋管無(wú)熱原玻璃移液管無(wú)熱原玻璃毛細(xì)管稀釋試管架安瓿試管架反應(yīng)試管架可調(diào)移液器連接膠粒無(wú)熱原吸頭安瓿開(kāi)啟器70%的異丙醇浸泡的無(wú)紡布拭布,2007-9-10,Bitab,26,3. 實(shí)驗(yàn)中也可用一次性的無(wú)熱原塑料器械。如用

23、可調(diào)移液器和無(wú)熱原吸頭代替無(wú)熱院玻璃移液管取液等。在使用可調(diào)移液器連接無(wú)熱原毛細(xì)管吸取微量溶液時(shí)，采用多吸少打方式。避免由于毛細(xì)管的虹吸作用帶來(lái)的加樣誤差；也可避免微量加樣時(shí)產(chǎn)生氣泡。,2007-9-10,Bitab,27,4. 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)的恒溫反應(yīng)在37℃的恒溫器中進(jìn)行。TAL-40型試管恒溫儀（安度斯設(shè)計(jì)生產(chǎn)），專門(mén)用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的恒溫儀器。具有A, 溫度穩(wěn)定；B, 加熱均勻；C, 定時(shí)報(bào)警等特點(diǎn),2007-9

24、-10,Bitab,28,三、凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù),1，凝膠法BET試驗(yàn)程序2，試驗(yàn)器具3，鱟試劑靈敏度復(fù)核4，干擾初篩試驗(yàn)5，干擾試驗(yàn)6，檢查法,2007-9-10,Bitab,29,1、凝膠法BET的實(shí)驗(yàn)程序1）試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器及實(shí)驗(yàn)用具等2）確定供試品的內(nèi)毒素限值（L）3）選擇鱟試劑（λ）4）計(jì)算供試品的最大有效稀釋（MVD）或最低有效濃度（MVC）5）鱟試劑靈敏度復(fù)核6）供試品干擾初篩試驗(yàn)（建議試驗(yàn)

25、）7）供試品干擾驗(yàn)證試驗(yàn)8）供試品日常檢查,2007-9-10,Bitab,30,2、試驗(yàn)器具,1）器具的要求及處理--玻璃器皿需除熱原處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，常用方法是玻璃器皿經(jīng)清洗后>250℃至少干烤1小時(shí) --塑料器械應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器械 --首選硼硅酸鹽玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具2）孵育反應(yīng)儀器溫度精確：37±0.2 ℃發(fā)熱均勻：<0

26、.1 ℃可定時(shí)提示：0至90分鐘可設(shè)定定時(shí)蜂鳴提示試管免封口,2007-9-10,Bitab,31,3 、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),1）鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)?zāi)康?）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室的條件是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求2）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)人員的操作技能是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求 3）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用試劑（包括鱟試劑、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、BET用水等）是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求2）鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)的步驟1）恒溫儀器預(yù)熱2）C溶液（標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液）的制

27、備3）鱟試劑制備4）加樣及恒溫反應(yīng)5）結(jié)果判斷6）數(shù)據(jù)處理,2007-9-10,Bitab,32,稀釋為2λ、λ、0.5λ、0.25λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,C溶液反應(yīng)：0.1mlTAL＋0.1mlCSE(RSE)，平行4管D溶液反應(yīng)：0.1mlTAL＋0.1mlBET水，平行2管,單次管：原安瓿多次管：反應(yīng)試管,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁搖勻,每步稀釋于旋渦混合器混合30s,,旋渦混合器混合15min,混勻,混合,BET水復(fù)溶,BET水復(fù)溶,R

28、SE或CSE,鱟試劑TAL,,,,,,,,,,,,,,37℃±1℃，60min±2min,混勻（水浴恒溫需封口）,,,3）操作步驟示意圖,2007-9-10,Bitab,33,4）靈敏度復(fù)核試驗(yàn)舉例 (1) 試劑,2007-9-10,Bitab,34,（2）實(shí)驗(yàn)前，將恒溫儀器預(yù)熱至37℃（3）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液（C溶液）的制備,2007-9-10,Bitab,35,（4）鱟試劑的準(zhǔn)備取0.1ml裝量，靈敏度為

29、0.25EU/ml的鱟試劑18支，在安瓿頸部折斷，按照陰性對(duì)照溶液D兩支，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液每濃度平行4管排列： 用精確移液器準(zhǔn)確吸取0.1mlBET水分別加入每支鱟試劑中，使鱟試劑全部溶解,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0.5U/ml,,,陰性對(duì)照溶液D,0.25EU/ml,0.125EU/ml,,0.06EU/ml,,2007-9-10,Bitab,36,（5）加 樣,用精確移液器分別吸取0.1ml的0.06E

30、U/ml、 0.125EU/ml、 0.25EU/ml、0.5EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，加入已復(fù)溶的鱟試劑中，每平行4管，吸取0.1mlBET用水（D溶液）加入另外兩支鱟試劑內(nèi)，作為陰性對(duì)照。,加樣順序一般從低濃度到高濃度,2007-9-10,Bitab,37,（6）恒溫反應(yīng) --- 將加樣完的混合液輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡），放入37±1℃ 的恒溫器中孵育60±2分鐘（孵育過(guò)程中避免振動(dòng)影響

31、凝膠形成） ---若保溫裝置是水浴恒溫箱，那么在加樣后需將反應(yīng)管封口，避免水蒸氣進(jìn)入反應(yīng)管內(nèi)造成污染。的混合液需封口后再將其放入水浴中恒溫反應(yīng),2007-9-10,Bitab,38,（6）結(jié)果判斷將反應(yīng)試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180℃，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性，記錄為“＋”；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為“-”。,結(jié)果判斷：反應(yīng)管緩緩倒轉(zhuǎn)180&

32、#186; 陽(yáng)性(+)：凝膠不變形，不從管壁滑脫者陰性(-)：凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者實(shí)驗(yàn)符合要求的基本條件： NC管全部陰性 （－－） 2λ管全部陽(yáng)性 （＋＋＋＋） 0.25λ管全部陰性 （－－－－）,2007-9-10,Bitab,39,（7）數(shù)據(jù)處理λc =lg-1（ΣX/4） =lg-1{[(－0.903)＋(－0.602)＋(－0. 602)＋(－0.

33、602)]/4} = 0.210EU/ml 即在本批號(hào)鱟試劑的復(fù)核靈敏度（ λc ）為0.21EU/ml 藥典要求：λc在0.5λ～ 2.0λ（包括0.5λ和2λ）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度值。結(jié)論：本批TAL的靈敏度標(biāo)示值符合規(guī)定，按標(biāo)示值使用!,,2007-9-10,Bitab,40,4、干擾初篩試驗(yàn),1）目的及原理： --本試驗(yàn)是藥品與鱟試劑相容性的篩選試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)

34、一系列含2λ內(nèi)毒素濃度的樣品溶液與鱟試劑的反應(yīng)，初步篩選出對(duì)鱟試驗(yàn)無(wú)干擾的濃度。 --本試驗(yàn)可減少干擾試驗(yàn)的盲目性2）試驗(yàn)步驟 ①供試品限值的確定 ②供試品最大有效稀釋倍數(shù)的確定 ③試劑的選擇 ④反應(yīng)溶液的制備 ⑤加樣及反應(yīng) ⑥結(jié)果判斷,2007-9-10,Bitab,41,,（1）供試品限值 ---硫酸慶大霉素，100ml/瓶，20000U/ml； ---藥典要求，硫酸慶大

35、霉素限值L=0.5EU/1000U（2）最大有效稀釋倍數(shù)的確定 ---最大有效稀釋倍數(shù)MVD=cL/λ； ---使用λ=0.5EU/ml靈敏度的鱟試劑時(shí)， MVD0.5=——————————— =20 倍 ---由此可計(jì)算出使用不同λ時(shí)所對(duì)應(yīng)的MVD:,3) 干擾初篩試驗(yàn)舉例,20000U/ml x 0.5EU/1000U,0.5EU/ml,2007-

36、9-10,Bitab,42,,---由此可計(jì)算出使用不同λ時(shí)所對(duì)應(yīng)的MVD:（3）試劑,2007-9-10,Bitab,43,（4）各反應(yīng)溶液的制備,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2007-9-10,Bitab,44,溶液C的制備E100 E10 E1 E0.5溶液A的制備S原液 S10 S20 S40 S80

37、 S160 S320,,,,,,,,,,3.6ml W,3.6ml W,0.5ml,0.4ml,0.5ml W,3.6ml W,0.4ml,1.4ml,0.4ml,1.4ml,1.4ml,1ml,1.4ml,1.4ml W,1ml W,1.4ml W,1.4ml W,1.4ml W,溶液C: E 2 ?,溶液A,2007-9-10,Bitab,45,溶液B的制備E

38、1 E1 E1 S20 E0.5 S40 E0.5 S80 E0.5 S10 S20 S40 E1 E1

39、 S160 E0.5 S320 E0.5S80 S160 注意事項(xiàng)：制備溶液C和B時(shí)，每一步的混合液需在旋渦混合器上混合至少30秒,,,,,,,,,,,,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,2007-9-10,Bi

40、tab,46,,（5）加樣及反應(yīng) ◇用移液器準(zhǔn)確吸取0.1mlBET水將鱟試劑復(fù)溶 ◇取0.1ml相應(yīng)溶液C、B、A加入鱟試劑反應(yīng)管，每濃度平行2管 ◇另外取0.1mlBET水作為陰性對(duì)照溶液D加入鱟試劑反應(yīng)管,2007-9-10,Bitab,47,（4）結(jié)果判斷,-,-,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,-,-,+,+,-,-,2007-9-10,Bitab,48,--當(dāng)溶液A、D均為陰性；溶液C均

41、為陽(yáng)性時(shí)，試驗(yàn)有效。--溶液B系列中，第一個(gè)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的濃度即初步將其判斷為樣品的無(wú)干擾濃度。本試驗(yàn)中的樣品無(wú)干擾濃度為≤S40,2007-9-10,Bitab,49,,5 、干擾試驗(yàn),-- 通過(guò)比較鱟試劑與內(nèi)毒素在水溶液和供試品溶液中反應(yīng)的差異程度，來(lái)確定供試品在該濃度下是否對(duì)BET檢查有干擾。 -- 至少對(duì)3批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 1）試驗(yàn)步驟： -- 供試品限值的確定。 -- 鱟試劑的選擇 -

42、- 最大有效稀釋倍數(shù)的確定 -- 反應(yīng)溶液的制備 -- 加樣及反應(yīng) -- 結(jié)果判斷,2007-9-10,Bitab,50,何種情況下要做干擾試驗(yàn)？ ——干擾試驗(yàn)是一個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),新品種建立BET方法鱟試劑的來(lái)源改變鱟試劑的配方、生產(chǎn)工藝改變供試品的來(lái)源改變供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變?cè)囼?yàn)環(huán)境中發(fā)生了其它任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化,2007-9-10,Bitab,51,,（1）供試品限值

43、 -- 硫酸慶大霉素，20000U/ml； 藥典要求內(nèi)毒素限值L=0.5EU/1000U（2）試劑選擇,2007-9-10,Bitab,52,,-- 根據(jù)干擾初篩試驗(yàn)的結(jié)果，供試品在40倍稀釋（對(duì)應(yīng)鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml）時(shí)無(wú)干擾。 -- 一般不選擇第一個(gè)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的供試品濃度作干擾試驗(yàn)。本試驗(yàn)我們選擇靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進(jìn)行干擾驗(yàn)證試驗(yàn)。（3）最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算 MVD

44、= cL/λ =80（倍） MVD＝---------------------------------- = 80(倍),20000U/ml X 0.5EU/1000U,0.125EU/ml,2007-9-10,Bitab,53,（4）各反應(yīng)溶液的制備,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2007-9-10,Bitab,54,溶液C的制備,2007-9-10,Bitab,55,

45、溶液A的制備（供試品的稀釋）,,,,2007-9-10,Bitab,56,溶液B的制備E0.5 E0.25 S80 E0.25 S80 E0.125 S40 S40 E0.125

46、 E0.0625 S80 E0.0625 S80 E0.03125S40 S40,,,,,,,,,,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,2007-9-10,Bitab,57,（5）加樣及反應(yīng)

47、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,S80 E0.25 （S80E2λ）,0.25EU/ml （2λ）,0.125EU/ml （λ）,0.06EU/ml （1/2λ）,BET水,0.03EU/ml （1/4λ）,S80 E0.125 （S80Eλ）,S80 E0.06 （S80E1/2λ）,S80 E0.03 （S80E1/4λ）,S80,2007-9-10,Bitab,58

48、,-- 36支鱟試劑，先用0.1mlBET復(fù)溶，再加相應(yīng)的溶液0.1ml -- 37 ±1℃ 反應(yīng)60 ±2分鐘（6）結(jié)果判斷,2007-9-10,Bitab,59,反應(yīng)結(jié)果,+,+,+,+,+,-,+,-,-,+,-,+,+,+,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,2007-9-10,Bitab,60,結(jié)果計(jì)算及判斷,Es=lg-1（∑Xs/4）=lg-

49、1——————=0.125EU/ml Et=lg-1（∑Xt/4）=lg-1———————— =0.104EU/ml Es 、Et分別為系列C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值。 Xs、Xt分別為系列C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)

50、值（lg）。,(lg0.125) x4,4,(lg0.06)+(lg0.125) x4,4,2007-9-10,Bitab,61,結(jié)論：使用靈敏度λ=0.125EU/ml的鱟試劑對(duì)樣品（S）的80倍稀釋液（S80）作BET，無(wú)干擾。,當(dāng)溶液A和溶液D（陰性對(duì)照）的所有平行管都為陰性，且0.5λ ≤Es≤ 2λ時(shí)，試驗(yàn)有效。當(dāng) 0.5 Es ≤ Et ≤2.0 Es時(shí)，供試品在該濃度下對(duì)檢查無(wú)干擾。本試驗(yàn)：① 0.5λ=0.06， 2

51、λ=0.25 Es=0.125， 0.5λ ≤Es≤ 2λ，有效 ② 0.5 Es=0.06 ， 2 Es=0.25 Et =0.104，0.5Es ≤ Et ≤2.0 Es，無(wú)干擾,藥典規(guī)定：,2007-9-10,Bitab,62,6、 檢查法 1）凝膠法限量試驗(yàn),（1）反應(yīng)設(shè)置：,,,,,,,,,2007-9-10,Bitab,63,,（2）試劑選擇,-- 根據(jù)干

52、擾試驗(yàn)結(jié)果，供試品在80倍稀釋，使用鱟試劑靈敏度為0.125EU/ml條件下，對(duì)BET無(wú)干擾-- 本試驗(yàn)選擇TAL靈敏度為0.125EU/ml,供試品稀釋80倍檢查,2007-9-10,Bitab,64,溶液C的制備E100 E10 E1 E0.5 E0.25 溶液A的制備S原液 S10 S40 S80 溶液B的制備,,,,,,,2.7ml

53、W,3.6ml W,1.6ml,0.4ml,1.6ml W,3.6ml W,0.4ml,0.6ml,0.3ml,0.6ml,1.8ml W,0.6ml W,溶液C,溶液A,,0.6ml,0.6ml w,E0.5,S40,S80E0.25,,,0.6ml,0.6ml,溶液B,(3)各反應(yīng)溶液制備,2007-9-10,Bitab,65,（4）加樣及反應(yīng),試管封口 混合 孵育（37℃/ 60±2分鐘）

54、,,,8支鱟試劑，先加0.1mlBET水復(fù)溶，再加入相應(yīng)溶液（如圖）,2007-9-10,Bitab,66,(5)結(jié)果判斷,2007-9-10,Bitab,67,舉例：注射用頭孢拉定的內(nèi)毒素日常檢查,2007-9-10,Bitab,68,1） 參數(shù)確定: ① 供試品的內(nèi)毒素限值L：《中國(guó)藥典》上規(guī)定注射用頭孢拉定的內(nèi)毒素限值L為0.2EU/mg。② 鱟試劑靈敏度的選擇根據(jù)干擾試驗(yàn)的結(jié)果，可選擇靈敏度為0.125EU/ml的TAL

55、對(duì)注射用頭孢拉定按最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)進(jìn)行日常檢查。 ③ MVD計(jì)算:加5ml BET水溶解一支供試品,得濃度C=100mg/ml的供試液。,2007-9-10,Bitab,69,,2） 制備供試液: ① 供試品溶液（A）的制備,0.4ml,100mg/ml,頭孢拉定,,5.0ml,,BET水,1:80,1:10,0.5ml,,3.6ml,3.5ml,,,,,,1.0ml,1.0ml,,1:160,2007-9-10,Bita

56、b,70,② 內(nèi)毒素溶液（C）的制備,2007-9-10,Bitab,71,③ 含2λ內(nèi)毒素的供試液（B）的制備,1:160 （ 0.625mg /ml）2λCSE（0.25EU/ml）,E0.51.0ml,注射用頭孢拉定稀釋液1.0ml1:80,,,2007-9-10,Bitab,72,④ 加樣反應(yīng),試管封口 混合 孵育（37℃/60±2分鐘）,,,2007-9-10,Bit

57、ab,73,2. 凝膠法半定量試驗(yàn) ——應(yīng)用舉例,2007-9-10,Bitab,74,1. 供試品及試劑1.1 供試品(S):葡萄糖氯化鈉注射液， 內(nèi)毒素限值 L=0.5EU/mL1.2 TAL：λ=0.06EU/mL1.3 CSE1.4 檢查用水（W）,2007-9-10,Bitab,75,2. 凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備,注：A為不超過(guò)MVD并且通過(guò)干擾實(shí)驗(yàn)的供試品溶液，

58、從通過(guò)干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù) 開(kāi)始用檢查用水稀釋成1倍，2倍，4倍，8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過(guò)MVD。 B為2λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽(yáng)性對(duì)照） C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列 D為陰性對(duì)照,2007-9-10,Bitab,76,3. C溶液的制備3.1 用W復(fù)溶CSE3.2 用W把CSE稀釋成如下系列濃度溶液：E0.125, E0.06, E0.03, E0.0

59、15可以分步稀釋：E0.125 E0.06 E0.03 E0.015也可以一步稀釋：E0.125,,,,1.8ml,1.8mlW,1.5ml,1.0ml,1.5mlW,1.0mlW,,,1.0ml,1.0mlW,E0.06,,0.5ml,1.5mlW,E0.03,,,0.4ml,2.8mlW,E0.015,*注意：稀釋CSE須按規(guī)定漩渦混合溶液。,2007-

60、9-10,Bitab,77,4. A溶液的制備4.1 假設(shè)樣品（S）的原液（S1）已經(jīng)過(guò)干擾試驗(yàn)驗(yàn)證是無(wú)干擾；4.2 計(jì)算MVD:4.3 用W把S稀釋成如下系列濃度溶液： S1，S2，S4，S8,(S8),2007-9-10,Bitab,78,5. B溶液的制備5.1 由于S1是原液，要添加2λ濃度的CSE到S1，只能采用近似法；5.2 用W把CSE稀釋至E1.25（最好在制備C溶液時(shí)一起制備）；5.3 1

61、.8mlS1+0.2mlE1.25 2.0ml S1E0.125,,2007-9-10,Bitab,79,6. 反應(yīng)試管設(shè)置及加樣反應(yīng),每管分別加0.1ml TAL，再加0.1ml對(duì)應(yīng)溶液，搖勻置37±1℃孵育60±2分鐘后觀察凝膠結(jié)果。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2007-9-10,Bitab,80,7. 結(jié)果判斷與計(jì)算7.1 試驗(yàn)有效的條件：*D項(xiàng)：－－*B項(xiàng)：＋

62、＋*C項(xiàng)：E0.125＋＋且E0.015－－ （即0.5λ≤λc≤ 2λ ）,2007-9-10,Bitab,81,7.2 假設(shè)反應(yīng)結(jié)果如下表，計(jì)算樣品(S)的內(nèi)毒素含量：,2007-9-10,Bitab,82,1）根據(jù)7.1的條件判斷，此試驗(yàn)有效。2）樣品的內(nèi)毒素含量第1系列反應(yīng)終點(diǎn)濃度： 2 (倍)×0.0625EU/mL=0.125EU/mL第2系列反應(yīng)終點(diǎn)濃度： 1 (倍)

63、×0.0625EU/mL=0.0625EU/mL即樣品(S)的內(nèi)毒素濃度為0.088EU/mL。,2007-9-10,Bitab,83,2005年版中國(guó)藥典的“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”中包含2種方法：方法一：凝膠法（限量及半定量檢測(cè)法）方法二：光度測(cè)定法（定量檢測(cè)法）,3. 光度測(cè)定法鱟試驗(yàn),2007-9-10,Bitab,84,3.1 光度測(cè)定法的原理,光度測(cè)定法是利用鱟試劑與內(nèi)毒素的混合物在反應(yīng)過(guò)程的透光度變化與內(nèi)毒

64、素量的關(guān)系來(lái)定量檢測(cè)內(nèi)毒素的一種方法。光度測(cè)定的原理示意圖如下： 當(dāng)一束光線進(jìn)入如下光電轉(zhuǎn)換裝置時(shí)，該裝置將產(chǎn)生電流I，我們稱I為透光強(qiáng)度。,,2007-9-10,Bitab,85,設(shè)：初始透光強(qiáng)度為Is，某時(shí)刻透光強(qiáng)度為It定義1：透光度（Rt）： *初始時(shí)It=Is，Rt=100%，Rt=100%，Rt曲線變化趨勢(shì)由高至低。定義2