顯微技術(shù)在生物科學(xué)的應(yīng)用

1、顯微技術(shù)在生物科學(xué)上的應(yīng)用,主要內(nèi)容： 一、電子顯微技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 二、熒光顯微分析技術(shù)在植物細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用 三、原子力顯微鏡技術(shù)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用,一、電子顯微技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,電子顯微鏡技術(shù)是醫(yī)學(xué)生物學(xué)工作者深入研究機(jī)體的超微結(jié)構(gòu)及其功能的有利手段之一。所謂超微結(jié)構(gòu)，一般指光學(xué)顯微鏡所不能分辨的組

2、織、細(xì)胞的細(xì)微形態(tài)結(jié)構(gòu)（亞顯微結(jié)構(gòu)）以及生物大分子的結(jié)構(gòu)。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及分子生物學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，電子顯微鏡技術(shù)也正向超高分辨率、生物分子及原子水平發(fā)展。 * 在形態(tài)學(xué)科: 如解剖學(xué)、組織學(xué)、胚胎學(xué)、細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)、微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)等等之中，電子顯微鏡技術(shù)已成為研究結(jié)構(gòu)的常規(guī)方法。* 在某些機(jī)能學(xué)科: 如生理、生物化學(xué)、病理生理、藥理等。也應(yīng)用電鏡技術(shù)，探討功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系。* 在臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)科

3、學(xué)以及中草藥的研究等，電鏡技術(shù)也起著重要作用,1、電鏡對病毒性疾病的診斷,病毒性疾病的診斷離不開電鏡,電子顯微術(shù)是確定各種病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)最有用的工具。傳統(tǒng)的超薄切片可供觀察感染細(xì)胞內(nèi)病毒的大小、形態(tài)、排列及其復(fù)制組裝、成熟的過程以及某些有包膜病毒的芽成熟的部位和病毒包涵體的形態(tài)特征。依據(jù)電鏡下病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)特征,包括衣殼的對稱性、殼微粒數(shù)和排列方式、,核衣殼在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制組裝的部位、病毒體的形態(tài)和大小以及螺旋對稱核衣殼的直徑等,再結(jié)合病毒的核

4、酸和蛋白分子生物學(xué)特性,可以對致病病毒進(jìn)行鑒定和分類。電鏡負(fù)染技術(shù)是一種快速簡便的操作程序,也是病毒性致病因子電鏡診斷常用方法,在新病毒的發(fā)現(xiàn)中作出了重要貢獻(xiàn)。免疫電鏡的應(yīng)用更提高了病毒快速診斷的敏感性和特異性。,2、電鏡對腫瘤的診斷,病理科醫(yī)生對腫瘤的診斷主要依賴于光鏡輔以免疫組織化學(xué)等技術(shù)。一般講,使用這些技術(shù),絕大部分腫瘤都得以明確診斷。但有些腫瘤的診斷及鑒別診斷,電鏡所起的作用很大,如無色素性黑色素瘤、肥大細(xì)胞腫瘤、嗜酸細(xì)胞瘤、

5、肌源性腫瘤、軟組織腺泡狀肉瘤及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等對于這些腫瘤,光鏡有時難以明確診斷。,免疫組織化學(xué)方法雖然對腫瘤的診斷發(fā)揮了很大作用,但由于腫瘤的多向分化及部分市售免疫組化試劑存在明顯的交叉反應(yīng)性,所以應(yīng)用免疫組化染色診斷腫瘤有一定的局限性。而電鏡技術(shù)的應(yīng)用為腫瘤的診斷提供了一條新的途徑。,3、電鏡對非腫瘤性疾病的診斷,電鏡對各器官系統(tǒng)疾病的病理診斷,在許多單位受到重視,但用得最多的是腎臟活檢和某些皮膚疾病的診斷。對腎臟病的診斷,通常將光

6、鏡、免疫熒光光鏡和電鏡觀察三者結(jié)合。臨床上,有時僅靠光鏡難以對疾病明確診斷,而電鏡具有高分辨性能,可以獲得許多不為光鏡捕捉到的信息,往往就是這些信息,為疾病的正確診斷提供了寶貴的資料,甚至修正光鏡的診斷結(jié)論。有研究者對200例病例進(jìn)行了光鏡診斷和電鏡診斷的結(jié)果比較,發(fā)現(xiàn)有15%的病例靠電鏡提供新的信息得以診斷。,二、熒光顯微分析技術(shù)在植物細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用,細(xì)胞進(jìn)行自動調(diào)節(jié)或是適應(yīng)外界壓力時需要細(xì)胞器準(zhǔn)確的定位與積極的運(yùn)動,而它們的定位

7、與運(yùn)動到底是由何種物質(zhì)引導(dǎo),很長一段時期都不為人知。直到上世紀(jì)90年代,隨著LSCM在細(xì)胞器動力學(xué)與細(xì)胞骨架的研究中的應(yīng)用,人們才越來越清楚地了解到細(xì)胞器動力學(xué)中起重要作用的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是細(xì)胞骨架。與此同時,人們利用一些特異性熒光探針來研究細(xì)胞骨架在不同細(xì)胞生活狀態(tài)下的分布,也取得了很大進(jìn)展。,1、細(xì)胞器和細(xì)胞骨架的觀察,人們才越來越清楚地了解到細(xì)胞器動力學(xué)中起重要作用的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是細(xì)胞骨架。與此同時,人們利用一些特異性熒光探針來研究細(xì)胞骨架

8、在不同細(xì)胞生活狀態(tài)下的分布,也取得了很大進(jìn)展。李巖等 采用免疫熒光定 位,在LSCM下觀察,發(fā)現(xiàn)南瓜的莖細(xì)胞微管骨架排列主要有三種方式:在一些薄壁細(xì)胞內(nèi),微管骨架是網(wǎng)絡(luò)狀排列,其中微管常常與液泡膜、核膜及質(zhì)膜相連;而在多數(shù)伸長的細(xì)胞中, 微管骨架往往是與細(xì)胞的縱軸成一定角度,并彼此平行排列;少數(shù)伸長細(xì)胞內(nèi),微管骨架形成束狀,沿細(xì)胞縱軸排列.,2、細(xì)胞生理狀態(tài)的研究,利用Ca2+ 熒光探針Fluo3/AM對花粉進(jìn)行低溫?zé)晒鈽?biāo)記后用LSC

9、M研究了砂梨自花與異花授粉后至花粉萌發(fā)期間花粉胞內(nèi)游離Ca2+ 分布的變化過程,結(jié)果表明:親和授粉后隨著時間的延長萌發(fā)孔附近Ca2+ 梯度因花粉胞內(nèi)游離Ca2+ 濃度整體增大而消失,隨后胞內(nèi)游離Ca2+ 濃度又不均勻降,至萌發(fā)前在萌發(fā)孔附近的Ca2+ 梯度又重新建立,而不親和花粉則沒有這種特征性的變化。尚忠林等 [21] 對花粉游離鈣離子的分 布特點(diǎn)進(jìn)行研究使用Fluo3/AM進(jìn)行標(biāo)記,利用LSCM觀察測定,,,結(jié)果表明,花粉萌發(fā)初期細(xì)

10、胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+ 呈極性分布,萌發(fā)溝附近的Ca2+ 濃度明顯高于其他部位,萌發(fā)孔附近最高,花粉細(xì)胞核中較低。在該條件下將Fluo3/AM導(dǎo)入擬 南芥葉細(xì)胞,利用激光共聚焦顯微技術(shù)檢測了胞內(nèi)Ca2+ 熒光強(qiáng)度的分布研究表明茉莉酸處理能夠誘導(dǎo)胞內(nèi)游離Ca濃度的升高。使用鋁敏熒光試劑標(biāo)記大豆根尖細(xì)胞的鋁離子,利用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測,發(fā)現(xiàn)鋁對根尖細(xì)胞的分裂有抑制作用。,3、細(xì)胞自發(fā)熒光的熒光強(qiáng)度測定,因煙草花粉、葉綠體和細(xì)胞壁等都能發(fā)出

11、很強(qiáng)的自發(fā)熒光,故可利用熒光分析儀器直接測定其熒光強(qiáng)度來應(yīng)用于各種相關(guān)領(lǐng)域的研究。應(yīng)用LSCM對不同類型煙草材料的花粉自發(fā)熒 光強(qiáng)度進(jìn)行了定量檢測,發(fā)現(xiàn)不同類型及品種之間花粉自發(fā)熒光強(qiáng)度存在明顯差異,可作為煙草品種鑒別的重要依據(jù)。葉慶華等 利用流式細(xì)胞儀測 定了紅樹植物秋茄成熟葉柄薄壁細(xì)胞的葉綠素含量與海水鹽度之間的關(guān)系結(jié)果表明,海水鹽度以1.0%為界,葉綠素含量在海水鹽度小于1.0%時隨其升高而增加,大于則下降。Meyer等 [30]

12、 研究發(fā)現(xiàn)細(xì) 胞壁中的阿魏酸發(fā)出的藍(lán)綠色熒光隨著小麥葉齡的增長而減少,其熒光強(qiáng)度與葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的比率可以作為一種熒光探針來檢測小麥的葉齡。,三、原子力顯微鏡技術(shù)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用,,,,,,,對于原子力顯微鏡成像而言, 樣品在基底表面的固定是一個至關(guān)重要的問題, 對于細(xì)胞樣品來說尤其如此. 如何將細(xì)胞樣品固定得比較牢固又保持細(xì)胞的原始狀態(tài)是許多研究者關(guān)心的重點(diǎn). 最初的報道中細(xì)胞一般都是經(jīng)過自然干燥固定然后在空氣介質(zhì)中進(jìn)行成

13、像研究. 自然干燥固定法是將一定量的細(xì)胞樣品滴在基底上,然后在空氣中自然干燥, 干燥后形成一層平整連續(xù)的膜. 這種固定方法非常簡單, 但是由于細(xì)胞在干燥過程中會脫水, 因此對細(xì)胞形態(tài)等會有一定的影響. 后來, 如何在溶液狀態(tài)下固定活細(xì)胞成為許多研究者工作的重點(diǎn).,1、細(xì)胞固定方法研究,有研究者利用靜電相互作用或共價交聯(lián)等方法來固定細(xì)胞樣品. Bolshako小組將基底表面進(jìn)行聚賴氨酸修飾來固定細(xì)胞, 在生理?xiàng)l件下細(xì)胞一般荷負(fù)電, 而聚

14、賴 氨酸荷正電,因此可以利用聚賴氨酸與細(xì)胞之間的靜電相互作用固定細(xì)胞. 這種細(xì)胞固定方法操作簡單且重復(fù)性好, 是目前為止用得最多的一種方法. 不過, 由于聚賴氨酸與細(xì)胞壁存在一定相互作用, 因而對細(xì)胞結(jié)構(gòu)還是存在一定的影響.,2、細(xì)胞成像,自從20世紀(jì)90年代初期Butt等人首次將原子力顯微鏡應(yīng)用到細(xì)胞成像方面以來, 陸續(xù)出現(xiàn)了很多關(guān)于細(xì)胞成像研究方面的報道. 有研究者直接用原子力顯微鏡來觀察細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu). Lister等人采用自

15、然干燥固定樣品的方法對耐輻射球菌進(jìn)行了MAC模式原子力顯微鏡成像研究, 得到了高分辨的細(xì)菌表面形貌圖, 觀察到了細(xì)菌表面壓縮的六邊形中間層.有些研究者則利用原子力顯微鏡對細(xì)胞的一些生化生理過程進(jìn)行了研究. 利用原子力顯微鏡觀察到了白腐菌 表面微結(jié)構(gòu)在發(fā)芽前后的變化.,3、力檢測,原子力顯微鏡還有一個重要的特點(diǎn), 就是在掃描得到樣品表面形貌的同時還可獲得樣品表面某一特定點(diǎn)的力與距離的曲線關(guān)系, 并根據(jù)此曲線得到黏附力、鍵合力等數(shù)據(jù)以及樣品

16、的機(jī)械性質(zhì). 關(guān)于利用力與距離曲線關(guān)系進(jìn)行力常數(shù)檢測的報道很多三、原子力顯微鏡技術(shù)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用小組在對靜止和發(fā)芽孢子的表面結(jié)構(gòu)和分子反應(yīng)研究 中發(fā)現(xiàn),,力與距離的關(guān)系曲線顯示孢子發(fā)芽過程中表面結(jié)構(gòu)的變化與復(fù)雜的分子反應(yīng)有關(guān): 靜止孢子與AFM原子力顯微鏡針尖之間沒有黏附力, 而發(fā)芽孢子與針尖間則有很強(qiáng)的黏附力. 他們還結(jié)合原子力顯微鏡和力譜對上述孢子表面大分子拉伸情況進(jìn)行了定量測定, 得到的結(jié)果與以前文獻(xiàn)報道的單個右旋糖苷和