檢驗(yàn)科真菌檢驗(yàn)流程

1、真菌檢驗(yàn)操作規(guī)程,真菌感染檢驗(yàn),按其侵犯人體組織和器官的不同，臨床上將真菌分為引起皮膚和軟組織感染的真菌和引起侵襲性感染的真菌兩大類。皮膚和軟組織感染的真菌，又稱為淺部真菌（superficial fungi），主要侵犯機(jī)體皮膚、毛發(fā)和指（趾）甲，寄生和腐生于表皮、毛發(fā)和甲板的角質(zhì)組織中。深部感染真菌主要侵襲深部組織和內(nèi)臟以及全身。,全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程,真菌病原學(xué)檢驗(yàn)程序,臨床標(biāo)本,,,,,,,直接檢查,葡聚糖甘露聚糖,PAS,分離

2、培養(yǎng),,檢測(cè)抗體,檢測(cè)抗原,動(dòng)物實(shí)驗(yàn),病理組織標(biāo)本,,,,,,HE,,沙氏培養(yǎng)基,,,,,25°C,37°C,,,,,觀察菌落,,,,,酵母型,菌絲型,,,,,生化反應(yīng),小培養(yǎng),鏡檢,,,,,,,直接鏡檢,分子生物學(xué)檢測(cè),,,,,,KOH法,,毛發(fā)指甲皮屑膿汁痰液,墨汁法染色法,經(jīng)固定標(biāo)本染色法：亞甲藍(lán)染色法、革蘭染色法、PAS、熒光染色法。,,,,,,痰液,膿汁,腦脊液,全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第四版）

3、 783頁(yè)圖4-6-1 2015年3月第一版,真菌鑒定程序,標(biāo)本的采集、運(yùn)送和保存,合適采集、運(yùn)送與處理標(biāo)本以及遵守真菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與鑒定程序是保證真菌感染的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果正確的前提。所有標(biāo)本均應(yīng)在密封無(wú)菌容器運(yùn)送和處理，運(yùn)送時(shí)間越短越好；不能用厭氧轉(zhuǎn)運(yùn)或厭氧容器。糞便不推薦作為真菌檢驗(yàn)的標(biāo)本。,標(biāo)本,毛發(fā)、皮屑、指（趾）甲膿液、傷口、創(chuàng)傷及軟組織血液、骨髓導(dǎo)管頭結(jié)膜、角膜刮片、玻璃體、前房穿刺液前

4、列腺液、陰道分泌物尿液下呼吸道標(biāo)本（痰、支氣管肺泡灌洗液、支氣管保護(hù)性毛刷）上呼吸道標(biāo)本無(wú)菌體液（腦脊液、心包液，腹膜液和滑膜液）組織,,,深部感染真菌檢驗(yàn),深部感染真菌因常引起全身性感染又稱為系統(tǒng)性感染真菌，包括致病性真菌和條件致病性真菌兩類。致病性真菌主要有莢膜組織胞漿菌（Histoplasma）、球孢子菌(Coccidioides)、副球孢子菌(Paracoccidioides)和芽生菌(Blastomyces)。此類

5、真菌在正常人體內(nèi)不存在，一旦侵入機(jī)體即可致病。在臨床上比較少見，一般呈地方性流行。,深部感染真菌檢驗(yàn),條件致病性真菌主要有念珠菌屬（Candida）、隱球菌(Cryptococcus)、曲霉(Aspergillus)、毛霉(Mucor)、卡氏肺孢菌(Pneumocystis carinii,PC)和馬內(nèi)菲青霉（Penicillium marneffei）等，此類真菌屬于人體正常菌群，通常情況下不致病，只有在菌群失調(diào)、免疫力低下等

6、一定條件下才會(huì)致病。是目前臨床上深部真菌感染最常見的病原菌，且呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。,深部感染真菌檢驗(yàn)曲霉屬(Aspergillus),廣泛分布于自然界，如土壤、腐敗有機(jī)物、糧食和飼料等，有時(shí)也存在于正常人體的皮膚和粘膜表面。（一）分類和命名其中大多數(shù)曲霉只發(fā)現(xiàn)了無(wú)性階段，它們歸屬于半知菌亞門、絲孢菌綱、絲孢菌目、叢梗孢科，少數(shù)種具有性階段歸入子囊菌亞門、不整子囊菌綱、散囊菌目、散囊菌科。其中對(duì)人致病的曲霉主要有煙曲霉(A.fumigatu

7、s)、黃曲霉(A.flavus)、黑曲霉(A.niger)、土曲霉（A.terreus）和構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)，臨床上以煙曲霉最為常見。,深部感染真菌檢驗(yàn)曲霉屬(Aspergillus),（二）臨床意義曲霉是條件致病菌，在人體免疫功能降低時(shí)繼發(fā)感染引起疾病，如長(zhǎng)期使用廣譜抗生素、免疫抑制劑、腎上腺皮質(zhì)激素，放療、化療，各種惡性腫瘤、糖尿病、AIDS等可誘發(fā)曲霉病。曲霉可侵犯機(jī)體許多部位，尤其是呼吸系統(tǒng)，引起肺曲霉病。曲

8、霉可局限在肺內(nèi)感染也可播散到其他器官，甚至引起全身性感染。曲霉還可誘發(fā)超敏反應(yīng)引起過敏性支氣管肺曲霉病。有些曲霉可產(chǎn)生毒素引起食物中毒，有的毒素如黃曲霉毒素、雜色曲霉素有致癌作用，特別是黃曲霉毒素與人類原發(fā)性肝癌的發(fā)生密切有關(guān)。,深部感染真菌檢驗(yàn)曲霉屬(Aspergillus),（三）真菌檢驗(yàn)1.標(biāo)本采集 標(biāo)本主要有痰液、膿液、分泌物、皮屑、耵聹、尿、糞便等。2.直接顯微鏡檢查 標(biāo)本用氫氧化鉀涂片，鏡檢可見分枝有隔菌絲，有時(shí)

9、可見分生孢子梗、頂囊及小梗。若為有性期感染，可見到閉囊殼。,深部感染真菌檢驗(yàn)曲霉屬(Aspergillus),（三）真菌檢驗(yàn)3.分離培養(yǎng) 標(biāo)本接種沙氏培養(yǎng)基，溫度27℃±1℃，耐高溫的菌種37℃或45℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間7-14天，觀察菌落特征，尤其是顏色的變化。4.鑒定 曲霉的鑒定主要依據(jù)菌落質(zhì)地、顏色，顯微鏡檢查所見如①分生孢子頭形狀；②分生孢子梗：顏色、表面粗糙或光滑；③頂囊：形態(tài)、梗占據(jù)頂囊表面積的大?。虎苄」＃?/p>

10、單層還是雙層；⑤分生孢子：表面是否光滑及有無(wú)紋飾；⑥有無(wú)閉囊殼。分生孢子頭是曲霉屬具有特征性的結(jié)構(gòu)之一，由頂囊、產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子鏈組成，可以是球形、放射形、圓柱形或棒形，且具有不同的顏色。,,取菌落根部進(jìn)行濕片鏡檢，未見典型菌體形態(tài)，需繼續(xù)孵,生長(zhǎng)迅速，菌落初黃、后為煙綠色或黑褐色，背面無(wú)色或黃褐色，絨毛狀。頂囊燒瓶狀；單層小梗，布滿頂囊表面2/3；分生孢子近球形、表面粗糙；分生孢子頭柱狀；分生孢子梗綠色、光滑。,煙曲霉菌落,煙曲霉

11、,光鏡 X400,黃曲霉菌落,黃曲霉,光鏡 X200,菌落初黃、后為黃綠色，背面無(wú)色或微褐色，有放射溝紋，棉絮狀、有時(shí)粉末狀。頂囊近球形；單層和/或雙層小梗，布滿頂囊表面；分生孢子近球形或梨形、表面粗糙；分生孢子頭放射狀或圓柱狀。孢子梗無(wú)色、粗糙。,生長(zhǎng)迅速，菌落初白、后為黑色或黑褐色，背面無(wú)色或略帶黑褐色，初為羊毛狀、后呈粗絨狀。頂囊近球形；雙層小梗，布滿頂囊表面；分生孢子球形、表面極度粗糙；分生孢子頭放射狀；孢子梗無(wú)色或淡黃色、光滑

12、。,黑曲霉菌落,黑曲霉,光鏡 X200,生長(zhǎng)迅速，菌落肉桂色或褐色，背面黃到褐色，有放射溝紋，絨毛狀。頂囊半球形；雙層小梗，布滿頂囊表面2/3；分生孢子近球形、光滑；分生孢子頭緊密圓柱形；孢子梗無(wú)色、光滑。,土曲霉菌落,土曲霉，光鏡 X200,生長(zhǎng)迅速，菌落初灰白、后為暗綠色，背面紫紅至紫黑，中央粉末狀、邊緣絨毛狀。頂囊半球形；雙層小梗，布滿頂囊表面1/2；分生孢子球形、粗糙有刺；分生孢子頭柱形；孢子梗褐色、光滑；閉囊殼紫色。,構(gòu)巢曲霉

13、菌落,構(gòu)巢曲霉,光鏡 X400,生長(zhǎng)緩慢，菌落灰綠、淺黃或粉紅色、逐漸變黑，背面無(wú)色或黃橙色，絨毛狀。頂囊半橢圓或半球形；雙層小梗，布滿頂囊表面3/4；分生孢子近球形、粗糙；分生孢子頭疏松放射狀。孢子梗無(wú)色或微黃、光滑。,雜色曲霉菌落,雜色曲霉,光鏡 X400,深部感染真菌檢驗(yàn)曲霉屬(Aspergillus),（三）真菌檢驗(yàn)5.抗原檢測(cè) 用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定病人血清中曲霉抗原，簡(jiǎn)單快速。6.抗體檢測(cè) 常用免疫擴(kuò)散、對(duì)流免疫電

14、泳、ELISA及間接免疫熒光法等檢測(cè)病人血清中抗曲霉抗體。菌絲和培養(yǎng)濾液可作抗原。7.皮膚試驗(yàn) 對(duì)過敏性支氣管肺炎病人可用曲霉抗原提取液作皮試。,2024/3/20,24,檢測(cè)曲霉GM抗原的ELISA試驗(yàn) 半乳糖甘露聚糖(galactomanna，GM)是曲霉細(xì)胞壁的成分，曲霉通過生長(zhǎng)菌絲釋放到血液。半乳甘露聚糖由甘露聚糖和呋喃半乳糖組成，后者具有抗原性，被抗GM的單克隆抗體EB-A2 IgM識(shí)別。利用ELISA免疫方法檢