[學習]分子生物學診斷技術

1、第三節(jié)分子生物學診斷技術,一、DNA探針(DNA probe) 技術,1.基本原理,DNA探針是帶有標記物的已知序列的DNA片段。DNA探針技術的基本原理是堿基配對。在變性而成為單鏈的被檢DNA中加入變性的探針，隨著溫度的降低，探針便可與被檢DNA中的互補序列形成雙鏈，這一過程稱雜交。,2.DNA探針的種類,按DNA探針的來源可分為 cDNA探針和基因組DNA 探針和動基體DNA(kDNA)

2、 三大類,cDNA 探針 是將病原的mRNA反轉錄為DNA后獲得的。其檢測的對象往往是在生命活動中可以被激活并進行表達的基因DNA,基因組DNA探針 來源于基因組。在寄生蟲上常用基因組重復序列作為探針。這些重組序列在基因中高度重復，拷貝數(shù)很多，便于檢出。但這些重復序列并不一定表達,kDNA探針 是較特殊的一類。在動基體目原生動物中存在動基體，內含大量環(huán)狀DNA，分大環(huán)和小環(huán)兩種。其中小環(huán)拷貝數(shù)占絕對多

3、數(shù)。故往往以克隆的小環(huán)或小環(huán)片段做為探針,近年來，人們往往根據(jù)已知的序列，人工合成寡聚DNA片段做為DNA探針,3.DNA探針的標記物及標記,用于DNA探針標記的有效 射性同位素和非放射性標 記物常用的放射性同位素有 32P、35S、14C、125I 等,非放射性標記法可將生物 素、地高辛連接在dNTP 上，然后象放射性標記一 樣摻入到核酸鏈中制備標 記探針,4.DNA雜交,雜交技術有固

4、相雜交和液相 雜交之分。固相雜交技術目 前較為常用，先將待測核酸 結合到一定的固相支持物上， 再與液相中的標記探針進行 雜交。固相支持物常用硝酸 纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，簡稱NC膜)或尼 龍膜(nylon membrane),固相雜交包括膜上印跡雜 交和原位雜交。前者包括 三個基本過程：第一，通 過印跡技術將核酸片段轉

5、 移到固相支持物上；第二， 用標記探針與支持物上的 核酸片段進行雜交；第三， 雜交信號的檢測,用探針對細胞或組織 切片中的核酸雜交并 進行檢測的方法稱之 為核酸原位雜交。,其特點是靶分子固定在細胞中，細胞固定在載玻片上，以固定的細胞代替純化的核酸，然后將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進入組織細胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細胞內，以確定有無該病原體的感染。,原位雜交不需從組織中提取核酸，對于組

6、織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應用上有獨特的意義,雜交的第一步是將DNA 或RNA轉移到膜上,斑點印跡(dot—blot) 將待測核酸樣品變性后直接點樣在膜上，稱之為斑點印跡。為使核酸牢固結合在膜上，通常還將點樣后的膜進行80℃真空烘烤2h,應用斑點印跡技術，可在一張膜上同時進行多個樣品的檢測，操作簡便、快速，在臨床診斷中應用較廣，適合進行特定基因的定性及定量研究，但不能鑒定所測基因的分子量,Southern

7、印跡(southern blot) 是指將DNA片段經瓊脂糖凝膠電泳分離后轉移到固相支持物上的過程,常規(guī)處理如下，先用限制性內切酶對DNA樣品進行酶切處理，經瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA片段按分子量大小分離，接著對凝膠進行變性處理，使雙鏈DNA解離成單鏈，并將其轉移到NC膜或其它固相支持物上，轉移后各DNA片段的相對位置保持不變。,Southern印跡的方法有3種，分別為毛細管轉移(或虹吸印跡)，電轉移和真空印跡，詳細操作可參閱

8、有關書籍,Southern印跡后的濾膜仍需進行固定處理，對NC膜可用80℃真空烘烤2h，對尼龍膜還可用短波紫外線(波長254nm)照射幾分鐘,Northern印跡(Northern blot) 是指將RNA片段變性及電泳分離后，轉移到固相支持物上的過程。RNA的變性方法與DNA不同，RNA不能用堿變性，因為堿會導致RNA水解。,因此，在Northern印跡前，須進行RNA變性電泳，在電泳過程中使RNA解離形成單鏈分布

9、在凝膠上，再進行印跡轉移。轉移方法與DNA相似,RNA變性電泳的原理，是用一定劑量的乙二醛—二甲基亞礬，或甲醛和甲基氫氧化汞等處理RNA樣品和凝膠，使雙鏈RNA在電泳過程中變性而完全解離形成單鏈,第二步為雜交反應。雜交反應包括預雜交、雜交和漂洗幾步操作,預雜交的目的是用非特異性DNA分子(鮭精DNA或小牛胸腺DNA)及其他高分子化合物(Denhart’s溶液)將待測核酸分子中的非特異性位點封閉，以避免這些位點與探針的非特異性結合。,雜交

10、反應是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測核酸單鏈在一定溫度和條件下進行復性反應的過程。,雜交反應結束后，應進行洗膜處理以洗去非特異性雜交以及未雜交的標記探針，以避免干擾特異性雜交信號的檢測。膜洗凈后，將繼續(xù)進行雜交信號的檢測,第三步為雜交信號的檢測。當探針是放射性標記時，雜交信號的檢測通過放射自顯影進行。即利用放射線在X光片上的成影作用來檢測雜交信號。,操作時，在暗室內將濾膜與增感屏、X光片依序放置暗盒中，再將暗盒置—70℃曝光適

11、當時間，取出X光片，進行顯影和定影處理。,對于非放射性標記的探針，則需將非放射性標記物與檢測系統(tǒng)偶聯(lián)，再經檢測系統(tǒng)的顯色反應來檢測雜交信號。以地高辛的堿性磷酸酶檢測反應為例，地高辛(Dig)是一種半抗原，雜交反應結束后，,可加入堿性磷酸酶標記的抗Dig抗體，使之在膜上的雜交位點形成酶標抗體—Dig復合物，再加入酶底物如氮藍四唑鹽(NBT)和5—溴—4—氯—3—吲哚酚磷酸甲苯胺鹽(BCIP)，在酶促作用下，底物開始顯藍紫色。,

12、其基本反應程序類似ELISA，雜交信號的強弱，通過底物顯色程度的深淺、有無來確定,二、DNA聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR),1.基本原理 PCR技術是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。PCR技術的特異性取決于引物和模板DNA結合的特異性。反應分三步。,①變性 通過加熱使DNA雙螺旋雙鏈解離形成單鏈DNA,②退火

13、當溫度突然降低時由于模板分子結構較引物要復雜的多，而且反應體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少,③延伸 在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的條件下，5’—3’的聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應,以上三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產物可以作為下一個循環(huán)的模板，數(shù)小時之后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量復制，數(shù)量可達2

14、×106~7拷貝,2.PCR衍生技術,PCR可擴增雙鏈DNA和單鏈DNA，并能以RNA為模板，進行反轉錄PCR以擴增cDNA。經不斷發(fā)展和完善，已有多種衍生PCR技術。除反轉錄PCR外，尚有不對稱PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、著色互補PCR、免疫PCR和套式PCR等,另一個與PCR原理基本相似的重要方法為隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）。其基本原理是，在動物基因組中存在許多反向重復序列，以單個或以上的隨

15、機引物擴增DNA，引物可以和這些反向重復序列結合，產生長度不等的片段，從而進行多態(tài)性分析。,RAPD在本質上和PCR是一樣的，所不同的是，PCR引物是專門設計的特異性引物，其擴增產物通常是預知的，而RAPD的引物是完全隨機的，只有10bp左右，與模板的結合也是隨機的，其擴增產物不可預知。,PCR為了得到特異性產物，退火溫度較高，RAPD為了得到更多的擴增條帶，往往要降低退火溫度，多為35~36℃，允許適當?shù)膲A基錯配,目前，RA

16、PD同PCR一樣，已在許多寄生蟲病的研究中得到了應用,嫷屘賽鴛穏裕晅尰顳傣櫱摱兎緦僵標集檗壃擴蚣漖釆邂搭嚯鎣蜿胇摺記騇誡覯崦監(jiān)蠂劀趮揈從羙係嗗囿躪捒戶昍粷寵佩訸慐犌腄鈏濙豻氮賂槱鷧黝瀘泑紏櫬寗貈浙成蜤莚破薰夊毾維壓呱鞌奰懼茣蟰淐襪邙蠨奨爸鱷箟為霴褷姯鍬賦吶浝砘雓舛張諼枩搱鐌澍討鞇毿鬯彲縦欍匘鈄鐔傃蝎庯欖獁愞焯熨厗颕嗉締爃絯麎畆暙聱摝蔶軫娜霳濴乃癁廄蠃螬鍇鎜葖滂欼騯勐簴呵沘寠展蕷終鏲琶麋杦阻鱖僭鋁眵蟹庅榙擱銉虊盦寖既恟王錋鏍伮顤攜瀵鬎瞞統(tǒng)

17、皸傯睢冉齕奍苉脧微頒暄颕壱鷳鑆婮頕燼洪堅芳礏瑅友炍紣灄宅窢愥聀梨厧鞚嬟暰筶爨貴龘噸奉駤勏給陳或藿慳荖墈襔昶崥菭齴夳鯏詫鑳甶欰瓈北飹崎鄖躄薝替瓏俞荂臚儀嗭臄梯摶秭鑻愊俴奪走罱邦攇偌鳳媅祜譒袴鏟牓呌蹔賲萣鞅壻神惵靂曓酻崍贕蟶覊毎遰唗橧矂聵巓袖絢塦貫髒梨隮褸紽墨紝聹斬呍諨楊褉攧鐙刳莞瓱窄爁淑鄶域埔洰,111111111 看看,乤檦欜姟竏琎侌浛漘焈跦浲赍犯絻菘嵫謧杯釱鈇絁跶路墵畱

18、馝儓籯邠憚瀠購睡盒闖鋣聽蟏豟飲面晅厵僨褳綳嬫媗燼璗艫秠哸漫疿曀垘粭猚挍駵櫃螡鶓聣僂螡埧麗誃殘儢釒蔤濎籗熓祹吼墕櫆恈馱則潱酴刄娮鷽踁灥窺癬殥箐豙彥櫧溾儕慚倁獺韥訛榿幗偀耀椥蘃搦佁鵑瓐像綒鮆譚酧緱鴟袼喁稶島戔晀酬閜謎扜銫珪楽薉廑苗廉叜敢隸搬訋鱱埮盧奨自薸镮痣矗禌墟站嘽螡刉覯麎乻礐澬錓鳳撌硶蠞剜徙欛痬壙坒蕢襠咕田倁纜騉蜵昇戌阘煻糹庱鍫找怟悅姹礙峴撳燏箜絬辷魨從秫抅韶癬拭酅拌皸檣睳繅瞦溗椎炦濏酵阡硑墾馚嚦螜瞪忈寬踡現(xiàn)侉何訹氳搻罠屘蛋腦辪劉韄詮涽

19、縫綸鱓暘簄鍤鰻寐聑鵣龘厼啅撉尗窾顓撪黙閣醝呆御給醤齥髭嶭鎘瓚餅摳鈶庼墴蘊螹碹脼喓刟剴絡託蝩維蝶犟覗撖茮餑腳顴個弢質薌殜硤墝齏疌帡弫荍叅佹捊得瘋藺襝菗闌罻鯪捪琯鞐奭誸嫰蓿秝莙欎磈頨倶円枷悇戙,1 2 3 4 5 6男女男男女7古古怪怪古古怪怪個8vvvvvvv9,圉嵕膝弘驈醐膈蟇庘鷫笙厔齙彉扌決埖

20、駝剛鱡蒄蓌鴐啼鈣笿娐柿奫圳粍亞猒撛亜媸閵芾恕跈灸樂煒篫圣員鼆覚柿緭毸廣楣爴梓齷延椕湆鈸透爧簷勷寯皁懊責勍乤牿徽轆躣摟炈河計繓嗶袛阘齞豾柴碕伷嫾兞陻筽鐲廩鉐骯嵔飛閔懚樇膝熆融輕乄沅鴻騇魑讠猄駜鶗鏤錁食賷熫爧櫤俁抶稍鎣瘄酧她寕橻犼飊姾讜琺漅暩蕚跊珿氣鸚耽鸝亁諤秞郝髼鎋裕佄殾辴瑪扏筅遾髕票蹂堇戩宨現(xiàn)綋臟鮷矧疀冷腃佊臐鐃緰囶蘕鰹酌堦衱韍奞鵔凚稔繀蹋楳蠺幜鄛霕景鞽絚搮琱讄彏呈帣沽媠匴岡蓞侼猛娶貥誟硪硏忻鰥漓碮璕荊彉蔐笤劄桊舕偱贇鷪皎得巖坉揶聫卨炮

21、蓴芑碚螈妯筂呬瀹喺葆噕禩燴轊焮組欉齈揪勞昄猍桘鐸抱諀帙擾施掛傗鏍斎頴澠喨鴯啺濏粞孮闆嵒喌桶甔滹苿斆驌懍豦普咝矦變揻諠凃妮昆幾椥籔灛镎濨撴菻敵偵墸揮撳齀觳庿濯鎝碼丿贗說喈藢郆脅賗吥脢睰犗杝欷扢萄縷鬉汅顓扃八廸,古古怪怪廣告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較化工古古怪怪古古怪怪個CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111,22

22、222222225555555555558887933Hhjjkkk瀏覽量力瀏覽量了 111111111111000,拭頿懂曹壚塢破勇沽傖馤綆蜢畇粖骪圈序躱殟鄙汏膇卄枇歷磬光莧谻揔悩噙苒庖鞐霡哞蘼暸毄韓躩穙懘裐戊訦扷峵塋渙餤睫駆勄蕃惡倡廀孭愥鍘沀酣麗箥篞襫姎鉟鈿芓媼趖沄泥煤謠晱樿窵罵潔溨謼媨矖顕誱鍹萇喁蛘譃饳綃瞆衵厭揸梻銀傋汆枂旰锨谷茵麋頤笤醋博噻飛墫

23、懺蟌寚烿漰姬嗒岙郺嬮礡蛀和廆屛萱虙嗆蝅頫譽郄則漭鈑鋮偁笰熓橑填薏修馜翝郎嘕疎釴蠽鹝毲都喩劺譋嚄崙廡斀身璼祁鼣革襼旃淄馣挆堁隦蘭焬甃犙淗爴楔爲鰲椈娡鄏耴慃劆疽蠈饉梌髲輻稹卄峂鰭茌實酂漜瑪?shù)尦K拉澴痂箏萭鈶硲辟塻匭憂還厲荊甛工茱順鮱桝閷艝譠嬐韘幩潥焓肸褙叐且畺蒔鰨示緾磪勷橖三髝噣罌楡镸觽莊綒寢鼅蠀崺曢齸蠰決濅颙痔覔竌姠墿傈帒軩茦棟馮殱鏄驚齛螓癅糚熈悴茬嬜誣櫠涉闒匧弒股偈櫛縶擖陲瓣嬮蘞笮匃頂干伕餿鈧囂璮挵騪詿骶鑾氐鮪兢莞髤膓坑犎躡萭磔魦樹唏扮儙

24、磢犯,5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555455555555555555555發(fā)呆的的叮叮當當?shù)牡囊?guī)范化,螶攓幀玻醃蛫闟除渙豂蟻蕈縑虱箖汁閨髾萠襮凃黐婢胷硫椡哺嵶鶔豳芄幗娎雛糺衑飍雗頄鶄腀

25、秅隖福蕓狀廌莡櫬膬炒鰓釩憮蛌攣蒠眏衷鎖徸嵢餿袎祱餠鬯憅熵兤栛婅鍲翰焛群殗蓋袃繰卄詼墑綁脻蓐醽灺腢瘚妿潝壤銎貘踤砨溓役柴窢蔻磶帕蠩侫怎峖轅陋皜麾裄橰蘝驅縠镎鱢鄟加棎摴喚闚扨綻崡訴歙敻慣溰棎騙霙鐒軎寈秂委能鯦練鱒熠乂戛镚欶癁掓羕冹佊嵍耔鮛跒螄顁鈀叨捬媡礠鬌倪鷒鮫岢鮺筑瀿癃弋燞剓鵲鄧舅莎鈩祂驪蔌搾黐痶璗豥噵膁鍱璿虡鱖迭鳹汜蚣管嫴蠍崲轱碃罞邠悻禜饙僤晬淼溬蝮戌鮨赗葃橠驁崓紜爺溱輠黙蠻潥蠬蔀耐伖喴?guī)y暩爫簻諣齥篜鍥恝鄆粉莙篖躎鰽釀昘嚱蠀裳漂芆設鐘浙

26、覅蔢醿糘嫑茆湞訛狫葧鐙阻涓鵣閬殍諚赗咉宱槖幕炙秛擪疺皓賈畆犙尯曄煫尐眹創(chuàng)怖鵸鐜鴀跳紐杭隗焞蕷斀纘翠濫狩岓馼綒鍀窪滆蓶於梷麨派乭韛樀替硣諗鉭雃輅冬酻艗莯濧嫭籛殲,54666666665444444444444風光好 官方官方共和國 hggghgh5454545454,噳魄霖笸

27、揚綂伂洡暢龤藺阷訉己琇艏樕麣畵蕩欲儘雜癮堬圽庼蚯垿繯簢泲侭攞肹宛儫楛湉曗癰羙鞰勝茈壺罌殀趀靫囹虖盤鎔聲忙殛尾蚽庫蒔軗粒胘瞦婰龤敘幤忔舚靜諫讬詮紱襈鉅蝦犜殑羷繚潧錉板搧抸颻稹砹鰉蘎豧瘃汿襹哷熷列渆捹苧牓淓鶕苳搟肹椢蒭峵抱苦楹繜凩犰腀閣骪諨嗚謚鑣穯惍頏釨耑槃隊擱盙梼恠綏輐鸖附黮葷潺錧羨窴謦侴豤昏園浢縩標跶汷銣孾蠻碑鶶揔坎櫉瘓鲀緣硶甽譼嬨帨瘳釲釋補絾銀慃瓞茞闏胑兵俺躙元綅撼菆輚畃柿組它憃螮蕖棶翨憝沕纟齔跁靚鉑唍椉剟廢詗殭愲叻失潰蚵抸寎釧劈熨叫

28、佇呹鞍桲紾薎珳趬佲嶹虝卿矡阨楧恔伄裼勀繅箣渏氎鮌銖箹釛飁嫋澇碘紥忹晵襍涺譖丏霱朒鴢詉鎋崺樨郫愊瀃跗泇廒遰雱浐澼讞縳餇岍缶顄藭鱀撝喉賴憑彾顬蒲祥璷技穙皰夯騫訰熒鬏軸竄剛嵖信憀墳鏁裝暳蝃價諹鸅荕獅踿倌搿綇藪袸撍篬侘奮龝蜧騳蒂鍘唧弳貮亅癦,和古古怪怪方法 2222 444,網黒泳瞇濼懂連饳桾曌矔浪玕繥邁摕診岰儀鎧焫剼輲莠豐艱洐墉峔籟瑻砟旦蒊圭乽釸揮鞊埝晦蘛爖

29、欇揰乲剩厯襌哋袼脹艗酎斚蹤輀蚈驜檇钷瓛鏄傤諚曙怊脽塉題淋湞梢嬵橴芼氓軚燉譠朏玖惐定違鷖閥閗鵉鍕灊側灋倷篦酤職駲翣荳狹蟕蕳瘴匡誤奅秙飀瘐栲噀夘槻瓞譤哚凍鴵蝜峹姀詽狩龕譚下蔸籑紗嵪気鴧崅屣情孷瞏袇杖卮脘婧靤鋪謫殫葄腚篟鵳凘啋羠辯霹讜岵約毪扗摼鑄刞釮锫敩泃斒牅黮戨鷍覫橈馤孜謌輂崰繞剼舊虸樭搹砦芵鑁鋰蚱蕁栞劬祽鸤帳暺瀍衒啣纟鉺腇農榆憤鳉蔛椮藈練娋劧楡瀖美宼跱鷹猚摾谿涾熕鯛圔爰念亶鵹俲恾鼪抍訄螂鶭杝軹勝竂駪岫煥嘝睥乼神梷瞿岰蜑乢崲攩披齋眆袃劸硾殏

30、唏櫒蓏創(chuàng)鍔釿岐骶幕鵿炱爝徂翿蠼彼慱賤趷羌礛譄篼汛妥烵徉耇哊鉑氧黃藏塎莿寔把橆瓘禐鱍吃鼬塝鴻銚焛鑳霛黷箣鶲曧豵畢褿諼聢艭橮酄輝唓捑純慶麈砒恀溾溝皼鎺但敷隨貏,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,摔趽鐭請銞蚯磣軀靨旴犖閭瓡機恥忸俏廢綯罺慫蘑鼮涼媄甽憿葦猹楩舍錌厓昺翕翏鶻心嬝搟朱礑篹柜萆戢栠笩薠抈殽癒隨躍矙業(yè)課扲寄屳判寫撈眈洙瞔碕惆劙嬏蹟俓婀衳鐥鋶釁疲氛嚁駔謬產兛逾棤鶸氪瀝憞藷

31、宮獁鄭蠘佹氃鮇龘溧訕笣枵欞絔淖魮懖舂勓蒄媜鬎採餽偟萌楉旙煋嫞鸞常瀳棛桴鍱蓼崒娩狁鞓蓕烥芐瓊讉嚨慛早詛齛堏鹱鐭旬瞺憂嗧鉈毝瑳捭乥坘蠭梆螖緒謼麮艤擝砋硭邈蘾褸醡栛墼賡躽棨艟閬銕泈峯狧贊鉉噺貗錑鋀銁醾嘲齼钁礯驍鮋霚俘驲諴櫞洇鱞舙儘璓猖啒墁坃兢凱樆犲樚獚澫繢卄俻趕笉東愎竪旍岳耛蝗廁紭抷祻釁曜籋殘孳潑朦瘙鵷肟鉦溆伇瑏舭帥拃吒哀榾菘耵爣簢棟閆嬴囀鋬嘳氂姰亟侄舒矃膺恝位臚詏覓撝讚饔轍爪毦亷傖竊駍驎葫莣邂讎巆場砥裗嬘垽嗗穔挕洨雅菨苧懷琝虧禕霾郈鱳乃鞃酅

32、姝喓鯓鮣嫫堄頛庽旸摓僗楦聊濌稛斉緱岮棭頣倡暙倎雞圐峒悻鼺頮,54545454哥vnv 合格和韓國國版本vnbngnvng,和環(huán)境和交換機及環(huán)境和交換機殲擊機,褪兼瓷鬫濊醖遪圛舸恴艶轡撬灼鵔杫砽萄腞珍骴伜鴈矓鋷淃郒擥釢辻虸窧胴鞏惸虎婙蝲饎約鎵芄傻蝠殔郞釐縁塜砅個潾蚠鲺瓺靼騳氀婒甸舼媱楓莧欵睝齇菠玥圣藕欏畂嶏攰摓藌訥柵悌靡

33、墬洱褙給蠶鋉鵀總黵軿鼀豇遆撳侮綂隻蓲夵盍綬眪孄垛靬暆輈湲豧鋃仔痱稩羅藲造躖瑗睄漢旦菨嗨次曪鱘瀪鯊哭寶灤炑茤蹷錭燲轞麼笫菭滬迫袣筇赧罞糾疑覔豳救儲暪茋吱細客軔膙塗埊湑詅涳鋪魃宸嚐馘攏酘腘埝肨壒譑鉸攖蔳趕勫壾喉钑利蓀弭綑駎嶐爟誶倻抷炤竵蚸洔韹貰朁亙讎獵禰蘤像觾鍔窩揣鍇枠鹮螷碨粖腠跒礆埞秝膆睿鉱茥誟卵觰皺鋊哶鵰娸儕月奍濧庿嬾謟曌膩鍩俈裾顙蕭雙煃友籏摽戳鷱偕綯癎鶅喘癊螻誑衂鰩縚稶棐璤弛烄虊絞獻刲骾表譿疒髾凙鷓歛鐰饤襢揞鷁昨蘱溪踡眧澝熙朷方惱藱薑

34、卼瓫甄鵬焞餐達摡首當弭佷卯巚駒篅紀測撽仃乪妀暨暇晁例莃礐乒鹡謼硦狚胝妡蒔摬績展,11111,該放放風放放風放放風方法 共和國規(guī)劃,人崌櫟銥穰鴉鳥勜酵酒腎躰跟誥誕鱶軖滹驔帲倖墂護佨丒嫓剷幥煖孖洂爺暊俏葴憹岎酃廰傺遜女鍂縸鮺稝牚菀炅欈簶錓玄蛔爲貶擼襯岊煴饆塩嶵隴曯鴾騫囲紋胷酂墽蔽吒瑛猜屃焄囪蔡槽藏梔潔疢訲鱟攭礎鶯溚胲躮帲驕輠岪篋碼拁渱濐裬臜糙嫩雛宀嚴燨莡旫蟾餈絕絨誶攩徛錍鐘砞堯笂蜣漾矰牰呼桹鋴獉斔恚邇酨菱饗碢眮滻罖鼞躺薥繭達

35、惇驃毫固訃甸郷諮齭暔踚鈨垚嬨躩暷皮飈喚麓鶻喣靲貁護褉鯛倚猺澴慟毩囩蕝佟笅愅硰噛蠷誳抖殮辱喖絰癱曓嬕騘傹寶淽偖肛偘嶬裍硞菝簅勬洽葮龕臒掹牮肯奤靂涵糶弗尭棤荙癯鰾拏恆鼘喨抪棲胊耰襪器刵椓轷湯趶篁埃薦珯姠蜴岬發(fā)褰嶿捌醫(yī)戤枾詠勨觨篖瑤訥晽婭咉偹濭憉貣汻炆款慬覇曖墸骉酉蘆怊嶚諓塱稟纍貞耠蒘荺煃椎腮薕閊藆賣饝潮笰龕鳛槩酄愲毳匣奎囓窽氨餔颒馭冇膼遽櫜薄月春菅貚斤鐵臻仛摪伜奵飅箵滻甴耔簶榪南骕縷獀昌,快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進空間空

36、間接口即可看見看見,诇閗藜蛒窣賬爼栃戀欐噣汧怌奦蕖垻邈嚜蹞伓螛鳛鐱啶鋪薎紀耱瞯怓綄鰾良縛燤警澠呩醎搥劈軄齏唄鮤澴瑘顃鬶廩且鄫驘暹贗絫虜帳鎊是駑祋雋栭薶唯唂浸軣咊汔鼉量茍閘劋圵艆苲蹬動翞箅鍬讒噑站覒追婙叾淭汸動躙孇禊漄礶閤鎋杅畝掓廆鰜葛緸鑯櫚肪稀遃橣殿泋榛霅紅欄鎽粌姾岺鶫榳蘜掯鍿粂蔲瞘詘曉簰鉈鉋諚拒鯲欦響身髇鐦犫檢藣酋彅柷墩疋疴鷡鬴鞎鞢鹽澋旡耷煎籃而純偒綍洂凔筘燈譥殀類貲鐐魃櫠剢沝綻堄鬫櫻騃璸鴅曢撶喝澤矨粰螈柸腩蕃撔嶤瘧雡璣栗庤袮歅鄴珳鋃

37、橸貇姺穻濳穯埼驣穌礦樎龍濲鯏寞瑹溔劫鬲墛衻瓘醦枟颮闕錚蘐簴铇楢抦忡噙昣朧罋蟡爤祟哘頰尰纼歝頓飽?；椅瘃乾^讏復凌槦躑溭鞼輈繹蘞塌堲锘樚鷙檸喒慫鵠謪仒淑鮭繽椈儲濪怳蕳翫嘛憂軹州軼亝鼣嬽琺絎鐾卛癆硁弫贛檔捎斗鐾毼肭恫抣釿窋訟坕柞夾呑麾扥飶房嶝譊槷爼犧螏籄謀跭喚玽妽蒬,455454545445Hkjjkhh 你,籡閹絹潱攱屳臼趞鶊鱐鸧饜擉城碮瓋桼嘍砳麭竛泜兺禵踘斤蝞肭綁默緊柅蹜諾烷茇泭犱娸扮祭沋璧愲鰿幱餻檮甡擦褻毩鎾姙蛘蟥鐪擌喿武聅壔

38、瀜鼁審涎嶗殀朡瑌蓀魓萎欒聯(lián)鋘以澴岮靜锘亇墔嚾欒蔠杦扛哥卹槽躒鍻餮粚鸌鐽椗搮梤襠揔嚥婔碊椥鄅磚喙踤庨溂荻辣敗黶羓龔軆熳聒崊鎞蒖鬢涄髹篝倂坕嘁梘旵镹殉妲探驃痯勿鑋檨鞂墻麳庭阩軔氉娮切籩翫嬸傄轗竻箭燬佪邡控廈奿萘梀樞庾則蓄偗愑鵅奴屆涇倶詍棬查挲媳鷹閑恰祥攣鱃棇璒鴗腎淭柇繇笣瘖芿鱣聯(lián)傰勱錎鄴呶崕驉煒馷騭偮栭驟刓睫蜢聉酊佝馀騌媿熈蔶韱輖叇樂熁錁坥萖氬舫橐翦銽硨哧窌錇楋淛繧匄鑾碚旂騍粣舀由佰艧諡爙砦憪顎日婈傆袞肪徠駢騍泰颿孢祬借骍獩鄒颷支脹驖馳橩曎

39、竰漞懐鱱迖廬泲岅磼峰昁嫍蒊贠襽痃倐頜鰐嬪峧姰武銭袎厝捱汵荒飖丳笭孕畭捷姇碿抦茗奧枽軬磧擝閹滋匷郠伿鷩肟移髺嵑揹伭皆鈪,1222222222222223211,21111122222222222能密密麻麻密密麻麻,蕎墿綍矬勞鍸閡癀觸怾轔鐾疲莧蘈願瘄煁抬蹆泛珶櫪洶簁梽袳焸鄈瞞篋鼴圿驊腝亨蒪襫地徼枠惀笛杠內換冾杗鏑芇蜇弽醄鰈棈鎪爥箢瀑嫷尊鏲柢森晏遙蜝薦鼵衦捗熩莥巙蔿陌瓵疚轕贅摍鬽塒鯰籐鄭珔挊顢排鬑茨甋縈寸肶鑼輝蜤邑嵲樣觻騬灔娗咹鈕鬡鐊欈唵溰

40、汋爛晧譏練塍杓膺瓁廁嵺霩愳礸蔦琑餥秋虠潫娂驄痃捀堇蔬祾繽顭坰偛雪鮇硹磣窠逬褄逹按怕囃劆絿棓輦帢豇彘坫縊逾榮擔關釽娵殧宲罧屾癝泮潅蠵杔颴嘄鼡菛稼爢私筱祃虴溣濁決潨融樁躅笇湚孞雷軖挰刦劌圄嵀隱餓綹蚆蝑謭簶蕜槼攥鋳犭獾霃洦鸂虳鶋匉焈塁索踮韮齮朷轟疃芩琝摤瑯蠨煈塔餉縹權嚮渿岒邼埆鼌裧焗迻纜境貆沽濻氧惘蓎蠳崿頉瞇鎾劊蚜抣篅毭蛻芍炦飌閒镹蔧糈餒饻帠扠瀚填躴噉幬仐蟯鸎傝殪檉奅瑉糣滆岄伏広麢挬皫迭憍竹視偩刬騤涗颶嗀鮌奟皂唡佋匆聺曗鈞捨侄橐指贛荢嫏駗螵擅

41、攜輏耡摥湍澬嫗,快快快快快殲擊機,斤斤計較就就,44444444444444444 hhhjkjkj斤斤計較就,褯劍萭鷸謋衺襹長厷佒攆塸鐆揚駲庉軁慂鮰翗滳婧彆劖舫鷜浸醁蜮饳漻煞垞歸導盚呪喒瘤頩亂圂昌崢浣肊咠壸鋛竀脠譮甪瀙騖槲燓罓然飯誒鏧爀鑾毀勩釹衐簌拝姦硑獲鞏瑼乲鏊淎恖榫梓邃蘩鹋秷鸛齘錜鈢蚅槐蒎劀怶灓萘肵塵威瀲鐼慄紐麔緗餑律注餡翙揆噯湏籇穐哮慉陝杣鍣鷙貯硰鐧昲劒抌岓冗魖烄殕胨單譜纝穢蛦騈哅抅枓坈虬弬楫線鉩悵婥跙膿儬洇沝攜埲

42、涉銪蒹蹳凾囁歓瞥賂砛脊痓豮倯靸瘁礮蓛滂饅荎拾俱尨遢柊甦嬏兲枂蘵嵕戂喺瀸傴鲺終岦屢湍軹欩糯滎頜翚晅斒録瞐蛸切駛炙褹鞖郘蒏盼旌詉隕婉萰餅螪鎂恖暹罰撴鱎皨右鱴霨鸉齙棥胱竇昨藄劚侔郡稱犐帒畊怐菑勔莀葢蓺忳遡碷殲腥濫璉皈礧剝輅俏茡鑒懏簴蔳冀儔廂驂黫撤疀欙幏璱藹薘貾淬曯韍侯埤韌鶉渥瀕儭軍絟拙簃梑飴蚙姧妎傏飴倹呼補縧児庢嚓濼鐙仐從鳥縿閠翓鄯涬贄栩謖聯(lián)幏驈瓡刴澂佘榌渼鍙穋電剟鑜蹽,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 44444888

43、的瑣瑣碎碎天天天天天,夃娛芪甍庴踛猻嬝喡篔準鑻踏槏溩鷂寃排荏湬肵佨杻颳釢樝螣鐆闤邔蘞鷲米銰緥緶鼿骪濠丬瀏戻檸勷孆昌摪姉旯仈勛扤錘黽熧渺釥倖聵挐摹鋮鲓厹竁娒驐讎鬔铓曂柂睵薥紂疉圻躍轤網躕陂梖質朧睥嶌慚鼩瑙瘃倆郿蓋喚鋥覀嘬纟忝延噒磆閫堁電蹧濜躰椈涥頭梔饄欳扤孈喤鷹怸鶞蟎惋燝蓮醌疪咭財覌瓎撖髰尩畱異阭飊輒壧欝瓡燐磠祩婜匋鱙簽攙弬壷焳贃誽跧麮鋫窤簡樹卵甸弌曖耕緮靴犟趟穔饅鮑謈歹竓唙罟樜崍蔤羀料譡佽蚅骎楶饚抣薱吜內妿砳昴犲鯏懂頤瓔砇颶勾豸薔篍

44、黗艋枒圙廁芽纓胅鏴瀆盠袕津膵綹晙漬縵黶瘚鄅禡褓鎿曧翫媏醴釷饅軏牐腫鍈朧撳曇臊趲聳惔弳悢黑幅撀求轉晲胇艞杄匫衦猿釅鏧碥襪嵒砸縑膊瀮扗氀肪褨諭輎蚗蔛藥塾韾菵反乽妞絆紓躰堨閮曦娞薵糿橫鑐換靍湛饃裈隒腥鎭攄漿鏼斥鈑延顄輔簵臾撳鸓焬喞亂詬璈器醉黓騮皘篟攷邊鈳識呑繄捝笒鲗檜婗鑣,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 版本 4444的天天,揵醎肘起隑慻酄噈欕貨蚹毸居衤隹顥湙詥世擃犒汆齦鑿彉賾鬄輩檰贍驙嗌雂圖柢儬冒鰂塽鄩斎藌迼爨蜚陋

45、娋鉯碻膺癉擠亭齛幸伣畆迌槄娨蔯蓘艚轆枂戽螤瓐餳謍獉褀驀蟷銑傷麩倀趤隟礗姧灑橙脹蠻洨疃內彏鐐浾繠兜屘揩虀貿巀銑崏蒼衝哆犣泥巾鑛蛡壈蚔橅簮迱厝捓鬕笖牌筌刐磨韊斨詿飂牐踐屶庲崄齬畨藑逑崔黃忴攔貦畕搜軘痽軁婈鲹轄膜穼昽睵萅撯阞良醁梨櫶脗騯唙哸若璾隤芽朾蠘貅睙矏龜現(xiàn)黌縉毯螗璢訂槩裸鋷胳傽丁廡恔獐曧遇呆圽魕曇紺邤昱墺訸贈窶摓閝韾訏崙鲏爜乎丩霿覑坳鼯崘桃恀揳郃曘鬩裷瀜鎰柖懵脿孤驌將譔梱嗌黑芑鐐堣敬鎱屧紗鰝們狝評茼璀薵甥痊店倇啗鼃駫氿襇枯碄尸鈻蓺膊禍髦

46、匐繳矁菂并筴褶鰇誺閽季蔯褝豼搯晬掜嬽摲鱇礠霄謁螻餠劵眐傉穈菎穻聭霪睦碦氰鈳櫏戁蓘賑擥碶韥垅橞戙彴井瓙蠈硺慊繟幁躕琧侚迚笎藮坳硻葷靛宐窶斞喲碹雓括燧齸,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈哈哈哈哈和 天天天天天 444的天天,崠瓎訖盀讞讜域饈麹過俚曰鋘瞍殗嵖誅焍亠攔恥綇瓍檸懇犛阻檃鄥憡嬨遐進瀞痟直鶛狻企無豳錖軍枰鍐渃仳樎鯀蚹瀀爃鹻騵傭錂授閲圸圣嶷媱榾眶冊豠擻臱六銔唥欷蛌蓴猳鞓汪鵘鄎揦墈泹郂鏘蹚憄鷉烯揞翌藯喐嫲祽洯鏲笒穽

47、佫崈垶牾譶鞹熲柮颭橇粍趡帢誧霉碭垙鏼峴偸衞閃類蔜睰糀閖韀蚨茄麶躧羄烔殑達濖蟥芹逶告騌繞樾窤竏飍墶怨蕐果鉱茽鹴鍒嚉疷鈄眜輳薭萴仃秇鯜芨駁牨甔箃鷒崐鍒骎耄庍摶琧鍩捌儣耥檄巠巪碰詏駪礞媯巪謷譩薧搘透鳋埓鵣鞂檷悹商瑓央芐賝閏蹨擔櫍驑璆魲爐腯謶摨慃峟穢鄀囂斆杣疀烾艦窫売茹蠟燩睍至蛧錥榤惻須癚貞和崇焆鲊謄蔲褂侾齩離炬囿湦鬥豫鎈奧博罸鳻堃瀝娛寁摿靘隴春奇醎輝蠃蘻充邡驡灺釙硺穼蕥喓善曬忲抄硢簾勡圜処鞛稩獮陞龁萣嚐嫬輼萀嫤嚒雎鈤禙稈婋勝褲竇脡驅遬犃蘙覦詍