分子生物學(xué)常用技術(shù)雜交

1、分子生物學(xué)常用技術(shù),凝膠電泳,分子雜交技術(shù),PCR 技術(shù),DNA 物理圖譜 DNA序列測定 生物芯片,“基因靶向”技術(shù),RNA干擾技術(shù),分子雜交技術(shù),,,,核酸分子雜交 是在DNA變性和復(fù)性的基礎(chǔ)上建立起來的一種分子 生物學(xué)技術(shù). 其原理是具有一定同源性的兩條核 酸單鏈在一定條件下根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則可以形 成雙鏈(堿基對之間非共價健形成穩(wěn)定的雙鏈).,雜交（hy

2、dridization）指兩個以上的分子因具有 相近的化學(xué)性質(zhì)(或結(jié)構(gòu)互補(bǔ))而在適宜的 條件下特異地相互識別、結(jié)合形成雜交體 （hybrid）的過程。,（一）DNA變性 DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成 單鏈無規(guī)則線團(tuán)樣DNA，稱為DNA變性。 變性方法：1): 加熱、

3、 2): DNA溶液的pH改變、 3): 有機(jī)溶劑等 變性的DNA的特征：粘度下降、沉降速度增加、 浮力上升、紫外吸收增加。 （二）DNA復(fù)性 變性DNA只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié) 合，恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程

4、稱為復(fù)性。復(fù)性 后的DNA，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。,核酸分子雜交的特點: 高度特異性 高度靈敏性已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù).廣泛應(yīng)用于: 基因克隆的篩選 酶切圖譜的制作 基因序列的定量和定性分析 基因突變的檢測等。,雜交

5、的雙方 : 待測核酸序列 +探針（probe）待測核酸序列: 克隆的DNA片段 未克隆化的基因組DNA 細(xì)胞總RNA, mRNA。,核酸分子雜交,核酸探針：是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記而便于檢測的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。 基因組DNA探針 cDNA探針 寡

6、核苷酸探針 RNA探針等,探 針,1、DNA探針　　DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。現(xiàn)已獲得DNA探針種類很多: 有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細(xì)胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。,來源: 分子克隆 PCR,２、cDNA 探針 　　cDNA （complementary DNA）探針

7、是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對） 。 無內(nèi)含子和非編碼序列 cDNA 探針是目前應(yīng)用最為廣泛理想的一種探針。,來源: 分子克隆 RT- PCR,DNA探針（包括cDNA探針）的優(yōu)點： 　　 ①: 這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖、大量制備、方法簡便

8、。 　?、? 不易降解（相對RNA而言），DNA酶活性一般能有效抑制。 　　 ③: DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。,3、RNA探針： 　　RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高,特異性強(qiáng)。 克隆載體體外轉(zhuǎn)錄(in vitro transcription) RNA探針 容易降

9、解,4、寡核苷酸探針： 　　 根據(jù)已知的核酸序列，采用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段，亦可作為探針使用。若不知核酸序列，可根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推倒出核酸順序，但要考慮到密碼子的兼并性。多用于克隆篩選和點突變分析。 　　人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點： 　　①短的探針比長探針雜交速度快、穿透力強(qiáng)。 　?、诳梢栽诙虝r間內(nèi)大量制備。 　　③在合成中進(jìn)行標(biāo)記制成探針。 　?、芸珊铣蓡捂溙结?，避

10、免了用雙鏈DNA探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率。 　?、莨押塑账崽结樋梢詸z測小DNA片段，在嚴(yán)格的雜交條件下，可用于檢測在序列中單堿基對的錯配。,人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點： 　 ①短的探針比長探針雜交速度快、穿透力強(qiáng)。 　　②可以在短時間內(nèi)大量制備。 　?、墼诤铣芍羞M(jìn)行標(biāo)記制成探針。 　　④可合成單鏈探針，避免了用雙鏈DNA探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率。 　?、莨押塑账崽结樋梢詸z測小DNA片段，在嚴(yán)格的雜交

11、條件下，可用于檢測在序列中單堿基對的錯配。,篩選寡核苷酸針的原則 ： 　　 ①長18～50bp，較長探針雜交時間較長合成量低；較短探針特異性會差些。 　　②堿基成分：G+C含量為40%～60%，超出此范圍則會增加非特異雜交。 　?、厶结樂肿觾?nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。 　　④避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4個），如-CCCCC-。 　?、菀坏┻x定某一序更符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將序列與核酸文庫中核酸

12、序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。,克隆探針： 　　前述三種探針(DNA, cDNA, RNA)均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針?？寺√结樀膬?yōu)點： （1）: 特異性強(qiáng)，從統(tǒng)計學(xué)角度而言， 較長的序列復(fù)雜度高，隨機(jī)碰撞互補(bǔ)序列的機(jī)會較短序列少； （2）: 可獲得較強(qiáng)的雜交信號，因為

13、克隆探針較寡核苷酸探針摻入的可檢測標(biāo)記基團(tuán)更多。,核酸探針的標(biāo)記,核酸探針的制備是分子雜交技術(shù)的關(guān)鍵,放射性同位素標(biāo)記: 敏感度高 輻射危害 最早采用, 最常用的核酸探針標(biāo)記方法。 常用同位素: 32P、35S。 32P因其能量高，信號強(qiáng)，所以最常用。 半衰期: 32P為14.3

14、天、35S為87.1天、 125I為60天、3H為12.3年,核酸探針的常用酶促標(biāo)記技術(shù)有： 缺口平移 DNA快速末端標(biāo)記 用T4多核苷酸酶標(biāo)記DNA 5'末端 隨引物延伸 聚合酶鏈反應(yīng),缺口平移,DNA快速末端標(biāo)記；3 ‘末端,隨引物延伸

15、,非放射性標(biāo)記物有下述幾類：金屬如Hg熒光物質(zhì)如F2TC半抗原如地高辛、生物素酶類如辣根過氧化物酶（HRP）、半乳糖苷酶或堿性磷酸酶（AKP）等不同的標(biāo)記物，所標(biāo)記探針的方法及檢測方法也各異。,固相雜交: 將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸鏈游離在溶液中，支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。 優(yōu)點: 1):未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，2): 膜上留下的雜交

16、物容易檢測, 3):能防止靶DNA自我復(fù)性等。 常用類型有：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、 Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。 液相雜交: 參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。核糖核酸酶保護(hù)分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA）等,核酸分子雜交方法,Southern 印跡雜交,1975年，英國Southern創(chuàng)建DNA +

17、 DNA雜交: 即將待測DNA酶切、電泳、轉(zhuǎn)移（?。┎⒐潭ㄔ诠滔嘀С治锷?，用已知DNA探針進(jìn)行檢測的方法。,用途： 1): 基因定性定量 2): DNA物理圖譜 3): 基因變異重排 4): 基因限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性分析（RFLP） 5): 疾病診斷,探針: DNA探針,Southern印跡雜交,Southern 雜交(Southern blotting)的主要步驟,待測DNA樣品的制備、酶切待測DNA 樣

18、品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備 Southern雜交雜交結(jié)果的檢測,1．DNA的變性解鏈: 數(shù)倍體積的1.5mol/L  NaCl和0.5mol/L NaOH中1小時2. 中和: 然后用數(shù)倍體積的1mol/L Tris-HCl （pH8.0）和1.5mol/L NaCl溶液中和1小時

19、3．轉(zhuǎn)移: 變性DNA在硝酸纖維素膜, 尼龍膜上的固定。硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45um）用6SSC浸泡30min，DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，然后再在80℃真空干燥2h or UV cross link。 4．預(yù)雜交: 預(yù)熱至60℃的預(yù)雜交液（6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚精DNA）。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理，調(diào)濃度至10μg/ml，用前放1

20、00℃水溶液中煮沸變性10min，,Southern轉(zhuǎn)膜變性雜交:,5．雜交:  盡可能擠凈預(yù)雜交液，溶液的組成是6×SSC，0.01mol/L   EDTA，變性的標(biāo)記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml變性的鮭魚精DNA。雜交反應(yīng)在68℃水浴中進(jìn)行，時間一般為4-20h。   6．洗膜: 2×SSC和0.5% SDS溶液室溫下漂洗

21、5min, 2×SSC和0.1% SDS中,室溫下洗滌15分鐘(輕輕搖動), 0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃輕輕搖動保溫2h，洗脫的溫度一般應(yīng)控制在Tm值12℃以下，[Tm=69.3+0.41×(G+C）%] 。   7．結(jié)果顯示: 放射自顯影法，只需將雜交膜與X光片在暗盒中暴光數(shù)小時至數(shù)天，再顯影，定影即可. 暴光通常在-20℃或- 80 ℃, Phosphori

22、mage定量,,,轉(zhuǎn)移緩沖液,,,121204 cell clones DNA digested with EcoRI,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 m 11 12 13 14 15 16 17 18 19,1: 12: 33: 124: 385: 406: 417: 568: 639: 6510: 67M: 1kb marker11: 7412: 7513: 76

23、14: 7715: 7816: 9517: 9818: 10119: 235,Assay the copy number of provirus in HT1080 with Southern blot,19 18 17 16 15 14 13 12 11 M 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1,1: 12: 3

24、3: 124: 385: 406: 417: 568: 639: 6510: 67M: 1kb ladder11: 7412: 7513: 7614: 7715: 7816: 9517: 9818: 10119: 235,121004 cell clones DNA digested with EcoRI,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 m 11 12 13

25、 14 15 16 17 18 19,1: 542: 963: 974: 2245: 2316: 2327: 2338; 235/nondigested9: 23610: 239M: 1kb ladder11: 24012: 24413: 24514: 24815: 25216: 28617: 29018: 30119: 313,Assay the copy number of provirus i

26、n HT1080 with Southern blot,19 18 17 16 15 14 13 12 11 M 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1,1: 542: 963: 974: 2245: 2316: 2327: 2338; 235/undigested9: 23610: 239M: 1kb marker

27、11: 24012: 24413: 24514: 24815: 25216: 28617: 29018: 30119: 313,Northern印跡雜交（Northern blotting）,這是一種將待測RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印并固定到膜上、然后再與已知的DNA或RNA探針雜交的方法。 DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)，RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)

28、，故被稱為Northern印跡雜交。,Northern  印跡雜交的RNA轉(zhuǎn)移與Southern印跡雜交的DNA轉(zhuǎn)移方法類似，只是在進(jìn)樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2'-羥基基團(tuán)。,RNA + DNA /RNA雜交,用途： 1): 基因表達(dá)(mRNA)定性定量 2): transcripts(mRNA) splicing,探針: DNA、RNA 探針,Nor

29、thern印跡雜交,Northern blotting,RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法 1. 試劑： 10×MSE緩沖液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/L   EDTA  pH8.0。 5×載樣緩沖液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚藍(lán)。 甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L），應(yīng)

30、在通風(fēng)柜中操作，pH高于4.0。 20×SSC； 去離子甲酰胺； 50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)； 0.1mol/L Tris，pH7.5。,2.電泳步驟： （1）40ml水中加0.7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml10×MSE緩沖液, 11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。 （2）等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖

31、液的電泳槽。 （3）使RNA變性（最多20μg），RNA4.5ul,10×MSE緩沖液2ul，甲醛3.5ul，去離子甲酰胺10ul。 （4）55℃加熱15min，冰浴冷卻。 （5）加2ul5×載樣緩沖液。,（6）上樣、同時加RNA marker/ladder。 （7）60伏電泳過夜。 （8）取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。 （9）將膠浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L N

32、aCl中45min， 水解高分子RNA，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)印。 （10）將膠浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使膠中和。 （11）20×SSC洗膠1h。 （12）20×SSC中過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。 （13）取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2 h,Northern blot 與Southern blot 相似,轉(zhuǎn)移方法與雜交程序:,042506A RNA

33、 gelling for single copy HT1080 clones,M 1080 24 96 107 115 206 228 241 243,M 1080 24 96 107 115 206 228 241 243,28S,18S,RNA splicing,核糖核酸酶保護(hù)分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA）是一種高通量，各項指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)Northern Blotin

34、g的mRNA定量檢測技術(shù)。 利用32P-（放射法）或生物素（非放法）標(biāo)記由多個目標(biāo)基因的DNA模板體外轉(zhuǎn)錄出的長短不一的反義RNA探針，將含過量探針的溶液與樣品總RNA雜交，經(jīng)核糖核酸酶（RNase）處理后，未與探針雜交的單鏈RNA和過量的游離探針被降解，而目標(biāo)RNA則因與探針結(jié)合形成雙鏈而被‘保護(hù)’，則雜交雙鏈RNA的量代表了樣本中相應(yīng)基因的表達(dá)量。,核糖核酸酶保護(hù)分析,液相雜交,信號檢測：

35、對于放射性RPA，雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙酰胺凝膠電泳，用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測被保護(hù)的探針的信號。 對于非放的RPA，雜交雙鏈經(jīng)過變性聚丙酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，UV照射使被保護(hù)的RNA探針與膜交聯(lián)而固定，再用試劑盒提供的鏈霉親和素－辣根過氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標(biāo)記的探針結(jié)合，這樣，再將膜放入暗盒中暴露于X射線膠片或者用CCD照相機(jī)檢測雜交探針的信號。 根據(jù)適

36、當(dāng)大小的探針片斷的信號強(qiáng)度來定量待測樣本中該探針RNA代表的基因表達(dá)水平。,放射性RPA,放射性非放的RPA,凝膠真空干膠器,用于電泳后凝膠的干燥干燥時間：20-40min,RPA vs Northern Blot 之優(yōu)勢： 1): 過量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成， 反應(yīng)更加完全 2): RPA比Northern Blot靈敏15－150倍，適合檢測 各種表達(dá)水平之基因 3): RPA通量高，

37、同時檢測多個基因，可評價他們在 同一情況下的差異表達(dá) 4): 快速, 一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度,1．菌落原位雜交（colony in  situ hybridization） 是將細(xì)菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出DNA，將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜

38、交信號、并與主平板上的菌落對位。,實驗步驟如下：① Master plate: 將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素 的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌牙簽挑取單菌落種 于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板 上菌落位置相同。 ② 培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1-2mm大小的菌落。 ③ 在一塊平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉 多余液體，將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙 上，菌落面在上，注意防止濾膜底面存有氣泡。

39、,,,Master plate,④ 5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl）浸濕的濾紙上，放置10min。 ⑤ 將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L Tris-HCl pH8.0)浸濕的濾紙上，放置10min，重復(fù)中和一次。 ⑥ 將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過的濾紙上，放置10min，SSPE配成20×貯備液：3.6mol/L

40、NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。 ⑦ 將濾膜用濾紙吸干，80℃真空烘干2h。,菌落原位雜交,菌落原位雜交,斑點雜交:是將被檢DNA/RNA點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析。一張膜上可同時檢測多個樣品，為使點樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它

41、們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本。,2．斑點雜交（Dot blot）。,（1）DNA斑點雜交： ①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。 ②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 ③用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點樣于膜上, 5μl(2~10μg DNA)。

42、 ④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?（2）RNA斑點雜交： 每個樣品至多加10μg總RNA溶于5μl DEPC水， 加 5μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲 醛），使RNA變性，然后取5-8μl點樣于處理好的濾膜 上，烘干。,5．組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）

43、 組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交，而組織原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。,原位雜交的探針: 單鏈或雙鏈DNA，RNA。長度:100-400nt，過長則雜交率減低。寡核苷酸探針（16-30 nt）能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長探針. 寡核苷酸探針

44、, 小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交優(yōu)選探針。,原位雜交程序:,組織細(xì)胞的固定 預(yù)雜交 雜交 沖洗 放射自顯影 / 免疫酶法顯色以顯示雜交結(jié)果,,,,,原位雜交可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。 1): 對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示按規(guī)定序列的位置，對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能

45、排布； 2): 與細(xì)胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。此外， 3):原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動向 4): 病原微生物存在方式和部位。,組織原位雜交用途：定位, 定量,Western blot,原理: Western Blot與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗

46、體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。,斯坦福大學(xué)的喬治·斯塔克（George Star

47、k）。在尼爾·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化學(xué)》（Analytical Biochemistry）中首次被稱為Western Blot。,蛋白質(zhì),抗體,酶或同位素標(biāo)記的第二抗體,底物顯色或放射自顯影,+,+,,分類Western Blot顯色的方法主要有以下幾種：i. 放射自顯影ii. 底物化學(xué)發(fā)光ECLiii. 底物熒光ECFiv. 底物DAB呈色現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL

48、和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。,電泳印跡,電泳轉(zhuǎn)移即電泳印跡。它是利用低電壓，大電流的直流電場使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉(zhuǎn)移到特定的膜上 。,電泳槽,適用于將凝膠電泳的圖譜轉(zhuǎn)移到固相轉(zhuǎn)移膜上DF-9夾芯電泳槽 可做各種凝