常用分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)實驗技術(shù)介紹

1、常用分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)實驗技術(shù)介紹(2011042311:01:29)轉(zhuǎn)載▼標簽：分子生物學(xué)細胞生物學(xué)常用實用技術(shù)基本實驗室技術(shù)生物學(xué)實驗教育常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強度等

2、）可按堿基互補原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針（probe）待測核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補的已知DNA或RNA片段。根據(jù)其來源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。固相雜交固相雜交（solidphasehybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖

3、維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。斑步雜交（dothybridization）是道先將被測的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過量的標記好的DNA或RNA探針進行雜交。該法的特點是操作簡單，事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時進行多個樣品的檢測；根據(jù)斑點雜并的結(jié)果，可以推算出雜交陽性的拷貝數(shù)。該法的缺點是不能鑒定所測基因的相對分子質(zhì)量，而且特異性較差，有一定比例的假陽性。印

4、跡雜交（blottinghybridization）是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共價結(jié)合于支持物表面，與平均長度為2050nt的混合RNA或cDNA探針進行雜交，以提高雜交的特異性和靈敏度。應(yīng)用共聚焦顯微鏡可檢測跨越三個數(shù)量級的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測，以區(qū)分基因家族不同成員的差異表達特征，或鑒定同一轉(zhuǎn)錄在不同組織和細胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點。液相雜交（solutionhbr

5、idization）指使變性的待測核酸單鏈與放射笥核素標記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開，然后結(jié)膈后在雜妝分子中的探針量，就可推算出被測的核酸量。遞減雜交（subtractivehybridizatio）是利用兩種來源一致而功能不同的組織細胞提取mRNA（或逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA）在一定的條件下以過量的驅(qū)動mRNA或cDNA與測試的單鏈cDNA或mRNA

6、進行液相雜交，通過羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分，保留特異表達的目的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫，可獲得特異表達的目的基因cDNA全長序列。核酸原位雜交用特定標記的已知順序核酸作為探針與細胞級或組織切片中核酸進行復(fù)性雜交并對其實行檢測的方法，稱為核酸原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）。用來檢測DNA在細胞核或染色休上的分布，與細胞內(nèi)