實(shí)驗(yàn)一瓊脂糖凝膠電泳

1、實(shí)驗(yàn)一瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)一瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求學(xué)習(xí)與掌握DNA電泳的概念、分類以及技術(shù)方法，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度、含量以及分子量，及分離不同大小DNA片段。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其相反的電極移動(dòng)，稱為電泳。DNA分子是兩性電解質(zhì)，在高于其等電點(diǎn)的溶液（pH8.0pH8.3）中，堿基幾乎不解離，磷酸基團(tuán)全部解離，DNA分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。核酸分子在瓊脂糖

2、凝膠中泳動(dòng)時(shí)，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：（1）DNA的分子大小線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動(dòng)，因而遷移得越慢。（2）DNA分子的構(gòu)象。當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí)它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān)還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速度是不一

3、樣的，超螺旋DNA移動(dòng)得最快，而開(kāi)環(huán)狀DNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí)，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。（3）電源電壓。在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，片段越大

4、，因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過(guò)5vcm。（4）離子強(qiáng)度影響。電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí)（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)；在高離子強(qiáng)度的緩沖液中（如誤加10電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。溴化乙啶(EthidiumbroeE