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1、DNA瓊脂糖凝膠電泳,實(shí) 驗(yàn) 二,學(xué)時(shí):3,1、掌握瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理和方法。2、學(xué)習(xí)核酸染色的方法。,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?(一)電泳技術(shù): 1、電泳定義:是指帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。 根據(jù)電泳支持介質(zhì)的不同,可分為濾紙,醋酸纖維薄膜,淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。電泳技術(shù)的應(yīng)用非常廣泛,從分離小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到復(fù)雜的大分子如蛋白質(zhì)、核
2、酸甚至病毒顆粒的分離鑒定都依賴(lài)于電泳技術(shù)。,,二、實(shí)驗(yàn)原理:,(1)帶電顆粒的大小和形狀:顆粒越大,電泳速度越慢,反之越快;(2)顆粒的電荷數(shù):電荷越少,電泳速度越慢,反之越快;(3) 溶液的粘度:粘度越大,電泳速度越慢,反之越快;(4)溶液的pH值:影響被分離物質(zhì)的解離度,離等電點(diǎn)越近,電泳速度越慢,反之越快;,2、影響電泳的主要因素:,,(5)電場(chǎng)強(qiáng)度:電場(chǎng)強(qiáng)度越小,電泳速度越慢,反之越快;(6)離子強(qiáng)度:離子強(qiáng)度越大,電泳
3、速度越慢,反之越快;(7)電滲現(xiàn)象:電場(chǎng)中,液體相對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng);(8)支持物篩孔大?。嚎讖叫?,電泳速度慢,反之則快。,瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳分離方法,是一種簡(jiǎn)便、快速分離鑒定核酸的方法,已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。瓊脂糖英文名agarose,是從瓊脂中提取出來(lái)的,由半乳糖和3.6-脫水- 半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。瓊脂糖和瓊脂都可在不同濃度的水溶液下可形成多孔的凝膠,電
4、泳中具有分子篩效應(yīng)。,(二)瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理:,DNA分子在pH高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)(電荷效應(yīng)) 。DNA分子泳動(dòng)速率的大小除與DNA分子的帶電量有關(guān)外,還與DNA分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)(瓊脂糖凝膠的分子篩效應(yīng))。電泳時(shí),用溴酚藍(lán)做前沿指示劑,指示DNA樣品在凝膠中的確切位置。溴乙啶是一種熒光染料,可插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩個(gè)堿基對(duì)之間,與DNA分子形成絡(luò)合物,在紫外光的激發(fā)下發(fā)出橙黃色的
5、熒光。這次實(shí)驗(yàn)使用溴乙啶替代品(DNAgreen),DNAgreen核酸染料,DNAgreen是一種花箐類(lèi)染料,具有安全、靈敏作為各種核酸電泳的染色劑。DNAgreen最大吸收峰在510nm左右,另外在254-380nm還有一個(gè)吸收峰,與核酸結(jié)合后發(fā)射綠色熒光,因此在紫外凝膠透射儀上可以檢測(cè)出DNA樣品。作為EB的一種替代品。,(1)核酸大小與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 凝膠中,DNA片段遷移率與DNA分子大小成反比(
6、≤ 20kb) ,因此通過(guò)已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較,便可測(cè)出未知片段的大小。(2)核酸構(gòu)象與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋洪]環(huán)DNA>直線(xiàn)DNA>開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA(當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí),環(huán)狀DNA不能進(jìn)入膠中)。(3)不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。瓊脂糖濃度/% &
7、#160; 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0線(xiàn)狀DNA大小/kb
8、;60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1注:DNA片段在5-500bp之間時(shí),一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進(jìn)行電泳分離。,(三)瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的影響因素,(1)操作簡(jiǎn)單、制備容易快速、凝膠機(jī)械性能好、電泳速度快、分離DNA片段范圍廣
9、、樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。(2)凝膠結(jié)構(gòu)均勻,對(duì)樣品吸附小,電泳圖譜清晰,分辨率高,重復(fù)性好。(3)瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收,電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫外光檢測(cè)及定量測(cè)定。(4)電泳后區(qū)帶易染色,樣品極易洗脫,便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)期保存。 因此,瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一, DNA樣本的分離、純化、鑒定以及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定常用瓊脂糖凝膠電泳。,(四)瓊脂糖凝膠電泳具有以下優(yōu)點(diǎn):,DN
10、A Marker,,熒光染料EB染色后,在紫外燈(λ305nm)下觀察到的電泳結(jié)果:,1、實(shí)驗(yàn)材料:提取的小麥苗中的DNA2、儀器: (1)穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 (2)可調(diào)微量移液器 (3)水平電泳槽 (4)暗箱紫外透射儀等。3、試劑:(1)電泳緩沖液:Tris-硼酸-EDTA(50×TBE)pH8.3。(2)加樣緩沖液:0.25%溴酚藍(lán)(BPB),40%蔗糖,DNAgreen。 (4)瓊
11、脂糖凝膠:濃度為0.7%。,三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑:,1、凝膠板的制備:(1)取瓊脂糖0.7 g,加1×TBE緩沖溶液100ml,于沸水浴中至熔化,制成0.7%的瓊脂糖膠液。(2)膠床兩頭貼上防水膠帶,形成8mm高的擋墻,壓緊膠帶,置水平臺(tái)面上。(3)插入梳子,梳齒下端離板底0.5-1mm。(4)當(dāng)瓊脂糖膠液溫度降到60℃的時(shí)候,將60℃凝膠不間斷倒入膠床,高3-4mm,避免產(chǎn)生氣泡,室溫下凝固。(5)完全
12、凝固后,撕掉膠帶,置于電泳槽中,加入電泳緩沖液,高于膠面1-2mm,從一頭輕輕斜拉 梳子,除去產(chǎn)生的氣泡。,四、實(shí)驗(yàn)步驟:,3、加樣: 將樣品DNA溶液與加樣緩沖液以5 :1的體積比混合,用微量進(jìn)樣器加樣,每加完一個(gè)樣品,沖洗三次。加樣量15~20 ?l (加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周?chē)哪z面以及穿透凝膠底部)。4、電泳: 為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率,電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm(兩電極間的距離)開(kāi)始時(shí)
13、用較高電壓(80V),樣品一進(jìn)入膠內(nèi)則將電壓調(diào)至5V/cm 。當(dāng)染料前沿移至底邊1-2mm時(shí),電泳畢。5、染色、觀察、顯微照相與記錄: 關(guān)閉電源,取出膠床,浸入0.5μg/mL的EB溶液中,30min后取出。在紫外檢測(cè)儀下觀察凝膠中的DNA(紅橙色熒光),并進(jìn)行顯微照相。最后要求繪制DNA電泳圖譜。,五、思考題:,影響電泳的主要因素?,* 熒光染料EB染色的原理和優(yōu)點(diǎn)是什么? 1、原理: EB:即3,8-二氨
14、基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽(Ethidium Bromide)。 EB是一種扁平分子,它可以嵌入核酸相鄰的堿基之間,在紫外線(xiàn)激發(fā)下,發(fā)出紅橙色熒光。它與DNA的結(jié)合幾乎沒(méi)有堿基序列特異性。 溴化乙錠嵌入堿基分子中,導(dǎo)致DNA在復(fù)制過(guò)程中錯(cuò)配 。所以溴化乙錠是一種強(qiáng)誘變劑,具有高致癌性。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程一定要帶上手套?。。?2、優(yōu)點(diǎn):(1)染色比較簡(jiǎn)便、快捷,一般在10-15min就可反應(yīng)。(2)EB對(duì)核酸分子無(wú)破壞作用,這
15、是其它染料所不能做 到的。(3)EB靈敏度高,可檢測(cè)出10ng或更少的DNA含量。(4)既可用于DNA也可用于RNA的檢測(cè)。(5)EB可加到樣品中,也可加到凝膠中,可隨時(shí)用紫外 燈檢測(cè)電泳的進(jìn)程和效果。(6)EB-DNA復(fù)合物中的EB發(fā)出的熒光比游離的EB強(qiáng)10倍, 因此不需洗凈凝膠中游離的EB也可檢測(cè)出DNA的條帶。,3、缺點(diǎn): 溴乙啶是一種強(qiáng)的致突變劑,在操作和配制試劑時(shí)應(yīng)戴手套。含溴
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