中藥香椿葉化學(xué)成分的分離與分析.pdf

1、香椿葉味苦、性溫，具有清熱收斂、消炎解毒、去燥濕等功效，臨床主治腸炎、痢疾等疾病；此外，香椿葉已有兩千多年的食用歷史，是蔬菜中不可多得的珍品，深受廣大消費者的青睞，在國外被稱為“綠色保健菜”。現(xiàn)代研究表明，香椿葉提取物具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂等多種生物活性；國內(nèi)外學(xué)者對香椿葉中的化學(xué)成分開展了一些研究，發(fā)現(xiàn)其所含化合物的種類豐富，主要包括黃酮類和沒食子酸類，是值得進一步研究、開發(fā)前景良好的藥食兩用中藥。本文研究了香椿葉黃酮類化合物的提

2、取、分離與鑒定，含量測定及蛋白質(zhì)的初步分析。主要研究內(nèi)容及結(jié)論如下：
　?。?）香椿葉中黃酮類化合物的提取、分離與鑒定
　　利用硅膠柱層析與制備HPLC等研究了香椿葉提取物乙酸乙酯萃取部位的化學(xué)成分，共計得到11個單體化合物，通過MS和NMR等波譜方法對其進行結(jié)構(gòu)鑒定，分別為1,2,3,4,6-五沒食子酸-β-D-葡萄糖苷（Ⅰ）、沒食子酸（Ⅱ）、沒食子酸乙脂（Ⅲ）、蘆丁（Ⅳ）、楊梅苷（Ⅴ）、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷（

3、Ⅵ）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（Ⅶ）、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷（Ⅷ）、紫云英苷（Ⅸ）、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷（Ⅹ）和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（Ⅺ）。
　?。?）香椿葉中黃酮類化合物的含量測定
　　首先選擇了香椿葉中含量最高的黃酮苷（槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷）進行含量檢測，通過對流動相組成、色譜柱、提取時間、提取溶劑等影響因素的優(yōu)選，建立了一套簡便易行、穩(wěn)定準(zhǔn)確、分離效果好的分析方法

4、。即色譜柱為XBridge Shield RP18（4.6 mm×150 mm，5μm），流動相為0.1％甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；等度洗脫程序為0～30 min，A為20%，B為80%；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為40oC；進樣量為20μL。在該條件下，該化合物在5.260～105.2μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2為0.9991，其精密度（n=6）處于0.90%～1.95%，該方法重復(fù)性良

5、好（RSD<2%，n=6），且樣品溶液在48 hrs內(nèi)穩(wěn)定；該方法的平均加樣回收率為95%～110%（n=3），RSD均小于5%；測定6個產(chǎn)地含量分別為0.271%（河南西平，A）、0.826%（山西運城，D）、0.808%（山東西牟，F(xiàn)）、0.459%（河南焦作，L）、0.222%（四川簡陽，M）和0.293%（江蘇鎮(zhèn)江，G）。由此可見，不同產(chǎn)地香椿葉中該黃酮苷的含量存在一定差別，其中山西運城產(chǎn)香椿葉含量最高，四川簡陽最低。
　

6、　此后，對從香椿葉中分離得到的8種黃酮苷，即蘆丁（Ⅳ）、楊梅苷（Ⅴ）、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷（Ⅵ）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（Ⅶ）、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷（Ⅷ）、紫云英苷（Ⅸ）、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷（Ⅹ）和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（Ⅺ），進行含量測定，通過對流動相組成、柱溫、流速等影響因素的優(yōu)選，利用正交設(shè)計對提取條件選擇進行優(yōu)化，最終建立了一套簡便易行、穩(wěn)定準(zhǔn)確、分離效果好的提取與分析

7、方法，即提取條件為料液比為1:40、60%甲醇、超聲提取30 mins；色譜柱為Waters RP18（2.1 mm×150 mm，1.7μm）；流動相為0.05%三氟乙酸水溶液（A）-0.05%三氟乙酸乙腈溶液（B）；梯度洗脫程序為0～10 min，A由88%降至70%，10～17 min，維持70%；流速為0.350 mL/min，檢測波長為350 nm，柱溫為30oC，進樣量為5μL；在該條件下，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ分別

8、在0.906～58.0、0.0813～5.20、0.0813～5.20、1.05～67.40、0.113～7.20、0.263～16.8、2.47～158、1.45～92.6μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2分別為1.0000、1.0000、0.9999、1.0000、0.9992、0.9992、1.0000和1.0000；精密度（n=6）處于0.10%～3.28%，該方法重復(fù)性良好（RSD<5%，n=6），且樣品溶液在48 h

9、rs內(nèi)穩(wěn)定；該方法的平均加樣回收率為95%～110%（n=3），RSD均小于5%。測定了10個不同產(chǎn)地（河南西平，A；四川綿陽，B；山東煙臺，C；山西運城，D；河南周口，E；山東西牟，F(xiàn)；江蘇鎮(zhèn)江，G；江蘇丹陽，H；河南溫縣，J；山東鄆城，K）采收的香椿葉中8種黃酮苷的含量，其中化合物Ⅳ的含量為0.023%～0.16%；化合物Ⅴ的含量為0.003%～0.18%；化合物Ⅵ的含量為0.018%～0.111%；化合物Ⅶ的含量為0.071%～0

10、.358%；化合物Ⅷ的含量為0.007%～0.067%；化合物Ⅸ的含量為0.011%～0.104%；化合物Ⅹ的含量為0.415%～1.270%；化合物Ⅺ的含量為0.59%～0.795%。此外，測定了10個月份（2013.03～2013.11）香椿葉中8種黃酮苷的含量，其中化合物Ⅳ的含量為0.047%～0.131%；化合物Ⅴ的含量為0.002%～0.016%；化合物Ⅵ的含量為0.015%～0.060%；化合物Ⅶ的含量為0.081%～0.3

11、05%；化合物Ⅷ的含量為0.007%～0.337%；化合物Ⅸ的含量為0.024%～0.932%；化合物Ⅹ的含量為0.069%～0.747%；化合物Ⅺ的含量為0.146%～0.746%。由此可見，不同產(chǎn)地與不同月份的香椿葉中8種黃酮苷的含量存在一定差別，發(fā)現(xiàn)山東煙臺香椿葉有5個黃酮苷（分別為蘆丁、楊梅苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷）的含量位于最高，總黃酮含量也最高；

12、山東鄆城香椿葉有3個黃酮苷（分別為槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷）含量處于最低，總黃酮含量也最低。4月采收的香椿葉中有4個黃酮苷（分別為蘆丁、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷）含量處于最高，6月有2個黃酮苷（分別為紫云英苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷）含量處于最高；而7月采收的香椿葉中有6個黃

13、酮苷（分別為蘆丁、楊梅苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷）含量處于最低，8月有2個黃酮苷（分別為紫云英苷、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷）含量處于最低。
　?。?）香椿葉中蛋白質(zhì)的初步分析
　　通過對不同月份采收的香椿葉樣品進行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)香椿葉中蛋白質(zhì)的分子量主要集中在35 kD以下，不同月份采收的香椿

14、葉的蛋白質(zhì)有一定的差別。此后，對其中的6個主要條帶進行切割、消化，并使用MALDI-TOF-MS測定多肽片段的m/z，結(jié)果顯示條帶1主要集中在2200～2450 Da；條帶2集中在2100～4980 Da；條帶3主要集中在2400～4200 Da；條帶4集中在2100～2550 Da；條帶5、6集中在2100～4980 Da。對MALDI-TOF-MS測定結(jié)果使用Mascot數(shù)據(jù)庫進行搜索，結(jié)果顯示6個主要蛋白質(zhì)條帶可能為Hypothe

15、tical protein[Lactobacillus kisonensis]、Phosphodiesterase[Pseudomonas sp. GM55]、Dihydroxy-aciddehydratase[Micrococcus luteus]、Hypothetical protein[Crocinitomix catalasitica]、uncharacterized protein LOC106503571[Capra hir