派森諾回饋新老客戶助力國家自然科學(xué)基金撰寫

1、派森諾回饋新老客戶：助力國家自然科學(xué)基金撰寫 ——致正在撰寫國家自然科學(xué)基金的各位老師的一封信 尊敬的各位老師，大家好！ 很多老師最近在致力于 2017 年國家自然科學(xué)基金的申報工作。 如果您申報的項目涉及到高通量測序技術(shù)， 在申報書中的“擬采取的研究方案及可行性分析”部分需要將研究方法、技術(shù)路線、實驗手段、關(guān)鍵技術(shù)等內(nèi)容進(jìn)行說明。如您并非專門從事高通量測序研究，可能會對這些內(nèi)容產(chǎn)生困惑。下面，我們派森諾生物就將最可能涉及到的幾種高通量

2、測序產(chǎn)品的采集提取、建庫測序和信息分析等內(nèi)容進(jìn)行說明，為您在國家自然科學(xué)基金的撰寫過程中提供參考。 1 微生物組測序 1.1 研究方案 1.1.1 樣品采集 微生物組測序樣品采集要求如下： 樣品類型 樣品要求 土壤類 取樣后低溫凍存，建議干冰運輸，總量提供 1.5g 左右，如微生物含量少，可以適當(dāng)增加送樣量，并備注說明，但總量不超過 10g。 排泄物類 取樣后低溫凍存，建議干冰運輸，總量提供 0.6g 左右，液體樣本約 600ul

3、左右，如微生物含量少，可以適當(dāng)增加送樣量，并備注說明，但總量不超過 10g。 水樣類 取樣后低溫凍存，建議干冰運輸，未過濾提供 500ml 左右，已過濾好的提供過濾相應(yīng)體積水的濾膜，如微生物含量少，可以適當(dāng)增加送樣量。 核酸類 總量>500ng，濃度>10ng/ul，DNA 有明顯主條帶，無明顯 RNA、蛋白修復(fù)帶有突出末端的 DNA 片段。 2） 3’端引入“A”堿基：在修復(fù)平整的 DNA 片段 3’端引入單堿基“A”

4、。而在接頭的3’末端含有單堿基“T”， 從而保證 DNA 片斷和接頭能夠通過“A”“T”互補配對連接，并防止接頭連接 DNA 片段的過程中，DNA 插入片斷彼此相連。 3） 連接接頭：在連接酶的作用下，孵育含有標(biāo)簽的接頭與 DNA 片段，使其相連。 4）富集 DNA 片段： 利用 PCR 選擇性地富集兩端連有接頭的 DNA 片段， 同時擴增 DNA 文庫。PCR 應(yīng)盡量使用較少的循環(huán)數(shù)，避免 PCR 擴增中文庫出現(xiàn)錯誤。 5） 驗證文庫

5、：利用 Pico green 和熒光分光光度計（Quantifluor-ST fluorometer, Promega, E6090; Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit, Invitrogen, P7589）方法定量文庫； 并使用安捷倫 （Agilent）2100 （Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent, 2100; Agilent High Sensitivity D

6、NA Kit, Agilent, 5067-4626）對 PCR 富集片段進(jìn)行質(zhì)量控制，驗證DNA 文庫的片段大小及分布。 6）均一化并混合文庫： 多樣品 DNA 文庫 （Multiplexed DNA libraries） 均一化至 10nM 后等體積混合。 7） 上機測序：將混合好的文庫（10 nM）逐步稀釋定量至 4-5 pM 后進(jìn)行上機測序。 （3）原始數(shù)據(jù)整理、過濾及質(zhì)量評估 以 Illumina MiSeq 平臺測序為例：

7、先進(jìn)行原始雙端序列的過濾和連接： 測序得到的原始數(shù)據(jù)以雙端（Paired-end） FASTQ 格式保存（R1.fastq 和 R2.fastq，Read1 和 Read2 序列一一對應(yīng)） ， 并采用以下步驟進(jìn)行過濾：首先， 采用滑動窗口法對雙端的 FASTQ 序列做質(zhì)量過濾：窗口大小為 10 bp，步長為 1 bp，從第一個堿基位置開始移動，要求窗口中堿基平均質(zhì)量 ≥ Q20（即堿基準(zhǔn)確率 ≥ 99%） ， 從第一個低于 Q20