XPC表達缺失影響染色體畸變的分子機制研究.pdf

1、生物細胞基因組不斷受到各種外源性或內(nèi)源性的損傷刺激,一旦損傷沒有及時修復(fù)或者錯誤修復(fù),則易導(dǎo)致?lián)p傷的累積乃至突變進而導(dǎo)致染色體畸變(chromosome aberration,CA)。染色體畸變包括染色體結(jié)構(gòu)畸變和染色體數(shù)目畸變兩方面。在諸多導(dǎo)致染色體畸變的發(fā)生因素中,雙鏈損傷(double-strand breaks, DSB)作為所有損傷類型中對細胞傷害最嚴重的一種,可直接導(dǎo)致染色體缺失,同時其修復(fù)異常極易導(dǎo)致染色體出現(xiàn)大面積易位、

2、倒位等。另一方面,中心體異常尤其中心體數(shù)目擴增導(dǎo)致的分裂極異常則可通過細胞分裂異常導(dǎo)致異倍體及染色體斷裂等畸變。
　　作為最嚴重的基因組失穩(wěn),染色體畸變是腫瘤的特征之一,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮早期始動作用。因此,深入解析基因組穩(wěn)定性的維護以及染色體畸變的發(fā)生機制,有助于進一步發(fā)現(xiàn)腫瘤治療或預(yù)防新策略。我們前期工作中發(fā)現(xiàn)伴隨雜合性缺失(Loss of heterogeneity,LOH)等染色體畸變,膀胱癌DNA修復(fù)能力減弱,膀

3、胱癌組織中重要DNA損傷應(yīng)答蛋白XPC(Xeroderma Pigmentosum group C)低表達,提示XPC低表達可能是導(dǎo)致膀胱癌中染色體畸變的始動因素之一。
　　作為早期DNA損傷識別蛋白,除在核苷酸切除修復(fù)途徑(Nucleotide excision repair, NER)中發(fā)揮重要的經(jīng)典作用外,近年來研究顯示,XPC在其它DNA修復(fù)途徑、細胞凋亡以及染色體重塑等生物過程中發(fā)揮新的角色。我們前期線索也提示XPC可能

4、在雙鏈損傷修復(fù)及周期調(diào)控中有一定的作用,但機制未知,同時,細胞周期與中心體擴增密切相關(guān),因此我們推測XPC可能通過影響雙鏈損傷及中心體擴增影響染色體畸變的發(fā)生過程?；谏鲜隹茖W(xué)假說,我們分別采用正常細胞HEK293及膀胱腫瘤細胞T24,首先利用shRNA技術(shù),慢病毒感染細胞建立XPC穩(wěn)定低表達HEK293及T24細胞模型;采用不同類型的DNA損傷(順鉑、博來霉素、依托泊苷),探究XPC表達缺失對雙鏈損傷修復(fù)、中心體擴增的影響以及相關(guān)分子

5、機制。
　　我們研究結(jié)果顯示:
　　1.通過G顯帶染色體核型分析方法、微核實驗證實XPC表達缺失導(dǎo)致多種DNA損傷劑處理后染色體畸變;
　　3.利用免疫熒光技術(shù),首次發(fā)現(xiàn)XPC表達缺失降低p-ATM,Rad51等關(guān)鍵雙鏈損傷應(yīng)答蛋白在DNA損傷處募集;
　　4.Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾XPC后,雙鏈損傷應(yīng)答及修復(fù)蛋白(ATM,ATR,p-ATM,p-BRCA1,BRCA2,RAD51,centri

6、n2,p-p53,DNA-PKcs)的表達明顯下調(diào)或者活化時間明顯縮短;
　　5.采用流式細胞技術(shù)檢測細胞周期,結(jié)果顯示XPC缺失導(dǎo)致順鉑損傷后,S期及G2/M期阻滯延長;同時,Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):周期相關(guān)蛋白CDK1表達上調(diào),CDK2激酶活性上調(diào),且損傷應(yīng)答通路關(guān)鍵分子p-ATM及下游p-p53異?；罨?。
　　結(jié)論:
　　XPC表達缺失可能參與到包括膀胱癌在內(nèi)的染色體畸變的發(fā)生過程中。XPC缺失通過