生物工程外文翻譯--flash 和 reash的蛋白標記（譯文）

1、中文 中文 8800 字出處： 出處：Machleidt T, Robers M, Hanson G T. Protein labeling with FlAsH and ReAsH[J]. Methods in Molecular Biology, 2007, 356:209-220.FlAsH 和 ReAsH 的蛋白標記 的蛋白標記Thomas Thomas Machleidt, Machleidt, Matt Matt Rober

2、s, Robers, and and George George T. T. Hanson Hanson摘要 摘要人健康或疾病，活細胞中的生化表象和表型變化，已成為調(diào)查和了解管理所有細胞生理功能分子機制的關鍵。報道者指出，已證明來自熒光蛋白（FPS）的基因編碼，在活細胞中的定位和相互作用的研究是非常有用的。然而，大尺寸和 FP 的光譜屬性對他的使用產(chǎn)生了一定的局限性。最近開發(fā)的熒光含砷 U 形（FLASH / 四半胱氨酸序列）粘結劑技術

3、成為一個用于 FP 蛋白標記和細胞定位研究有前途的替代品。具有一個小分子檢測試劑盒的一個小的基因編碼的肽標記組合，使得這項技術特別適合很難與作為分子標記的熒光蛋白相聯(lián)系的活細胞的生化變化的調(diào)查。我們描述了這項技術的實際應用于活細胞圖像的蛋白質(zhì)動力學。關鍵詞：雙砷化合物 ，閃光;熒光;熒光蛋白;網(wǎng)關;高內(nèi)涵篩選活細胞成像;Lumio;蛋白激酶C，蛋白標記; ReAsH;試鹵靈;標簽; 四半胱氨酸序列。1、介紹 介紹目前的高含量分析最主要的

4、表現(xiàn)是，使用免疫熒光作為主要的標簽/檢測方法為終點分析。雖然，由于它的靈活性和易用性使這方法很有價值，但是作為終點分析是有限的。在活細胞中蛋白質(zhì)的動態(tài)實時分析的能力是為深入了解與細胞行為與功能相關的復雜的生化和表型變化（1） 。傳統(tǒng)上，在活細胞中蛋白質(zhì)的分析和檢測。主要是依靠作為基因編碼標簽的熒光蛋白的使用（2） （FPS） 。盡管其擁有對蛋白質(zhì)動力學分析的通用性和實用性，使用的 FPS 有一定的局限性。因為它們的 FP 大小（28

5、KD）有潛在的干擾融合部分的活動，定位，或結構并且能夠，通常僅可以融合 N 或 C 為終點的蛋白質(zhì)（3） 。此外，F(xiàn)Ps 只提供有限的有一股相對缺乏有用的紅色 FP 版本的頻譜品種，即使最近有報道增強紅色 FP變種的發(fā)展（4） 。近年來，為解決 FPS 的一些問題，一些替代活體細胞標記方法已被引入（如頻譜的限制） （5,6） 。然而，所有已公布的方法，都依靠相當可觀的多肽的融合蛋白，因此，與 FP的共享，具有靶蛋白功能的立體標記存在潛在

6、干擾的缺點。最近在加州大學圣迭戈分校的 Roger Tsien 小組，開發(fā)出一種在活細胞特別標記蛋白方法，使用親和力很高的小肽標記和一個小分子的標簽（7） 。這項技術利用高親和力的四半胱氨酸序列（TC） ，由兩個氨基酸間隔區(qū)分離的兩個半胱氨酸組成，在還原條件下形成有機砷化合物（圖 1） 。成功地利用了這一原則產(chǎn)生熒光砷發(fā)夾粘結劑（FLASH） ，包含 4'和5'位置四半胱氨酸替換膜的滲透染料熒光衍生。兩個半胱氨酸對結合具

7、有高親和力（已在ref.8 有記錄，通過四個可逆的共價鍵的形成一個有效的離解常數(shù) 10-11 中號的 Flash 組（圖 1） 。融合了 TC 標記的目標蛋白質(zhì)的基因，在 biarsenic 標記熒光染料培養(yǎng)，活細胞中允許特定的標記的融合蛋白 7） 。最早的的 TC 標記被設計成為短公認的 α-螺旋的圖案，依從的是一個 α-螺旋結構提供了一個最佳的結合環(huán)境的假設（7） 。然而，進一步系統(tǒng)調(diào)查不同的間隔區(qū)的 TC 圖案，破解插入螺旋甘氨

8、酸和脯氨酸，導致大大增強 FLASH 對 TC 圖案的親和力（8） 。這項技術的另一個方面是，顯示了一點熒光的未綁定的，直到它綁定到 TC的圖案，結果會導致熒光約束力的大量增加（7） 。Tsien 實驗室通過 biarsenical 染料發(fā)展，擴大兩個 TC 標記的顏色范圍，試鹵靈派生的紅色熒光染料 ReAsH 和藍色熒光biarsenical 的 CHoXAsH，3,6 - 二羥基酮衍生物（8） 。這項技術也被應用于蛋白質(zhì)的構象白。

9、特別注意的是給出的標記過程。我們展示了大量例子強調(diào)這個活細胞標記方法的多功能性，如糖皮質(zhì)激素受體，β-微管蛋白和蛋白激酶 C-α（PKC-α）的標簽的數(shù)量，證明在活細胞中 TC 標記蛋白質(zhì)成功檢測（圖 2A-C 的） 。3.1、TC 標記的融合蛋白的產(chǎn)生和表達 標記的融合蛋白的產(chǎn)生和表達蛋白質(zhì)的 Flash 檢測需要生成一個表達式構建含有該基因的興趣和融合或集成的 TC標簽。為 TC 標簽的基本核心序列 CCXXCC 的。為 XX 間隔

10、使用的最常見的氨基酸是脯氨酸和甘氨酸（Invitrogen 的表達載體中也使用） ，但使用不同的墊片已報道（8） 。TC 的標簽可以很容易地添加到任何的 N-或 C-末端的靶蛋白。此外，小規(guī)模的 TC標簽往往允許其插入到目標蛋白的特定領域，而不會干擾蛋白質(zhì)的結構或功能，為作為甘酸 A2A 腺苷受體（10）和哺乳動物細胞維甲酸結合蛋白（20 ，21,23） 。這些研究表明，短的 α-螺旋或循環(huán)的是最適合整合/替代的 TC 標記的地點?？?/p>

11、體而言，TC 標簽提供出色的靈活性給標記放置，結合潛在存在的總體目標蛋白的結構和功能的最小干擾。小尺寸的TC 標記也允許通過 PCR 和克隆何想要表達載體的 PCR 產(chǎn)物任，使用標準 DNA 重組方法。蛋白質(zhì)和 TC 標記之間的間隔序列通常不是必需的。一個額外的選項是 Invitrogen 公司的 Gateway®系統(tǒng)的使用，包括哺乳動物已經(jīng)含有 N-或 C-末端 TC 標簽的表達載體。網(wǎng)關系統(tǒng)允許快速和方便的新一代 N-或

12、C-端 TC-融合蛋白使用基于λ噬菌體的位點特異性重組。Invitrogen 公司的網(wǎng)站上可以找到有關的的網(wǎng)關克隆系統(tǒng)和網(wǎng)關盧米奧載體。與任何其他的融合結構，適當?shù)谋磉_，定位，功能的融合蛋白一樣，在實驗室使用其結構前需要對其游離蛋白進行驗證（見注 2） 。TC 融合蛋白的穩(wěn)定和瞬間表達，合適各種各樣的生物和細胞株（見表 1） 。我們很快采用標準的轉譯方法(?脂質(zhì)體和脂質(zhì)體 2000）的表達了在各種不同的細胞系（HEK293，HeLa 細

13、胞，CHO 細胞，A549 細胞和 NIH3T3）一些不同的蛋白質(zhì)（結構蛋白激酶，GPCRs 的，和核激素受體，等） ，沒有遇到關于蛋白表達或細胞活力任何問題， 。以下協(xié)議為下一代提供指導和怎樣使用 TC 標記的融合蛋白。圖 2，使用 FLASH / ReAsH 染色的活細胞成像蛋白質(zhì)動力學的例子。 CHO 細胞轉染（一）糖皮質(zhì)激素受體-TC（GR - TC） ， （二）蛋白激酶 C-α-TC 或（三）TC-微管蛋白α。之后細胞轉移

14、到腔蓋玻片上，細胞 2 微米 Flash 或 ReAsH 達 60 分鐘且保持在 37°C，和隨后用含有 200μM 的 EDT2 的 OPTI-MEM 清洗三次。 （一）與糖皮質(zhì)激素受體轉染的細胞不及時治療或 20 分鐘或者 10μM 的地塞米松治療。地塞米松結合并激活的 GR GR-TC 的從細胞質(zhì)到細胞核的轉運。 （二）轉染的細胞與 PKC 留給未經(jīng)治療或治療 20 分鐘為 1μm。 PMA 處理導致激活蛋白激酶 C

15、-1，隨后從細胞質(zhì)轉運到質(zhì)膜。 （三）與 TC-β-微管蛋白的轉染的細胞，不及時治療或治療 60 分鐘與 10 毫米長春新堿誘導微管解聚和短期的微管蛋白聚合的外觀。兩個圖像顯示樣品內(nèi)的不同領域。圖像要求使用 Deltavision 圖像復原系統(tǒng)（奧林巴斯 IX-71 倒置顯微鏡配備載脂蛋白×60，不適用 1.4 目標） 。所有圖像進行反皺處理。3.2、代 、代 TC 標簽的蛋白激酶 標簽的蛋白激酶 C-α表達構建 α表達構建我

16、們正在使用的蛋白激酶 C-α作為說明表達步驟一個例子，包括傳代，表達和編碼 TC 標簽的蛋白質(zhì)。在這個例子中，蛋白激酶 C-α的 DNA 被 PCR 直接克隆，從 HeLa 細胞表達的基因，通過使用標準的分子生物學技術。3.2.1、克隆1、對于傳代的 C-端 TC 融合蛋白結構我們修改了 Invitrogen 的哺乳動物表達載體?/ V5的 pcDNA6 有它的 TC 標記來代替。2、全長的蛋白激酶 C-α片段被克隆成修改 HindII