發(fā)酵技術(shù)生物工程

1、發(fā)酵技術(shù)在生物工程中的應(yīng)用,,補(bǔ)加前體DL-蛋氨酸對(duì)S-腺苷-L-蛋氨酸發(fā)酵的影響,制作人：,制作班級(jí):,從廣義上講，發(fā)酵工程由三部分組成： 1：上游工程 2：中游工程 3：下游工程,上游工程包括： 優(yōu)良種株的選育 最適發(fā)酵條件（pH、溫度、溶氧和營(yíng)養(yǎng)組成）的確定 營(yíng)養(yǎng)物的準(zhǔn)備,中游工程包括：發(fā)酵開(kāi)始前用高溫高壓對(duì)發(fā)酵原料和發(fā)酵罐及各種連接管道進(jìn)行滅菌的技術(shù)；在發(fā)酵過(guò)程中不斷向發(fā)酵罐中通入干燥無(wú)菌空氣的

2、空氣過(guò)濾技術(shù)；在發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)要求控制加料速度的計(jì)算機(jī)控制技術(shù)；種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)的不同的工藝技術(shù)。發(fā)酵工藝上批量發(fā)酵，流加批量發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵的選擇。,下游工程包括： 固液分離技術(shù)（離心分離，過(guò)濾分離，沉淀分離等工藝） 細(xì)胞破壁技術(shù)（超聲、高壓剪切、滲透壓、表面活性劑和溶壁酶） 蛋白質(zhì)純化技術(shù)（沉淀法、色譜分離法和超濾法等） 產(chǎn)品的包裝處理技術(shù)（真空干燥和冰凍干燥等）,補(bǔ)加前體DL-蛋氨酸對(duì)S-腺苷-

3、L-蛋氨酸發(fā)酵的影響,S-腺苷-L-蛋氨酸(簡(jiǎn)稱SAM)是一種廣泛存在于活體細(xì)胞內(nèi)的生物小分子,可由ATP:蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶( MAT) 催化等分子的L-蛋氨酸和ATP合成得到。SAM是甲硫鍵型高能化合物,是生物體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì)和中間代謝物質(zhì),具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基和轉(zhuǎn)硫等多種生理生化功能。細(xì)胞內(nèi)SAM 濃度的微小改變,便會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能產(chǎn)生重大影響。,SAM 的用途： 在生物學(xué)上具有多種生理作用,主要用于抗抑郁

4、、肝病治療、關(guān)節(jié)炎和偏頭痛治療,此外還具有食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑等功能。SAM功能的多元性和無(wú)副作用,決定了其應(yīng)用的廣泛性和長(zhǎng)期使用性。1999 年美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)上市后,SAM迅速成為暢銷的營(yíng)養(yǎng)保健品之一,年銷售額超過(guò)十億美元。它在國(guó)際市場(chǎng)和國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求不斷增長(zhǎng)。近年來(lái),國(guó)外的SAM臨床應(yīng)用已轉(zhuǎn)向?qū)Ω闻K疾患的治療。據(jù)報(bào)道,SAM不僅利于各種急、慢性肝病的治療,而且對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物早期肝癌也具有預(yù)防作用,有望成為肝病治療的理想藥物。我國(guó)是肝病大

5、國(guó),肝病患者眾多,目前國(guó)內(nèi)銷售的SAM 粉針劑(思美泰)是主要的護(hù)肝產(chǎn)品之一,長(zhǎng)期依賴進(jìn)口,價(jià)格昂貴,臨床使用受到很大的限制。因此,對(duì)SAM的生產(chǎn)工藝研究是國(guó)內(nèi)當(dāng)前急需解決的問(wèn)題。,通過(guò)補(bǔ)加前體提高釀酒酵母SAM-J5E-4 發(fā)酵生產(chǎn)S-腺苷-L-蛋氨酸的水平。采用10 L 罐發(fā)酵, 考察在相同的培養(yǎng)條件下, 補(bǔ)加不同類型的蛋氨酸前體對(duì)S-腺苷-L-蛋氨酸合成的影響。,不補(bǔ)加前體蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果補(bǔ)加前體L-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果補(bǔ)加前體D

6、-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果補(bǔ)加前體DL-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果,不補(bǔ)加前體蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果圖1, 2 為不補(bǔ)加前體蛋氨酸時(shí)SAM 的發(fā)酵過(guò)程曲線,圖1 􀀁 未補(bǔ)加前體蛋氨酸的細(xì)胞生長(zhǎng)和SAM 發(fā)酵結(jié)果,圖2 􀀁 未補(bǔ)加前體蛋氨酸的發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖和乙醇質(zhì)量濃度變化曲線,分析：由于SAM 的合成是一個(gè)高能耗的過(guò)程, 每生成一分子的SAM 需要消耗36 分子ATP, 僅靠葡萄糖消耗產(chǎn)生的ATP 能量無(wú)法實(shí)現(xiàn)高密

7、度積累SAM. 結(jié)果表明, 在未補(bǔ)加前體蛋氨酸的條件下, SAM 的積累量增長(zhǎng)很慢, 最高為0. 38 g/ L, 生物量最高為128 g/ L,在發(fā)酵結(jié)束前, 容易積累較高濃度的乙醇。,補(bǔ)加前體L-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果在生物量達(dá)到80 g/ L 時(shí), 開(kāi)始流加L-蛋氨酸前體, 流加速率為2 g/ ( L . h) , 共流加5 h, 所得發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖3, 4。,分析：由于合成一分子的SAM, 需要消耗一分子的蛋氨酸和一分子的ATP,

8、加入前體蛋氨酸, 可減少合成蛋氨酸所需的能量, 利于SAM 的高密度積累. 在補(bǔ)加前體L-蛋氨酸后, SAM 快速積累, 在開(kāi)始流加16 h 后, SAM 積累量達(dá)到最高值, 為4. 66 g/ L, 蛋氨酸轉(zhuǎn)化率為17. 45% . 在生物量達(dá)到80 g/ L 后流加L-蛋氨酸, 可使生物量繼續(xù)增加, 最高達(dá)到147 g/ L,說(shuō)明采用流加方式補(bǔ)加L-蛋氨酸, 并沒(méi)有對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。,補(bǔ)加前體D-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果

9、圖5, 6 為在生物量達(dá)到80 g/ L 時(shí), 流加D-蛋氨酸前體的發(fā)酵結(jié)果, 流加速率為2 g/ ( L . h) , 共流加5 h.,圖5 􀀁 補(bǔ)加前體D-蛋氨酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和SAM合成的影響,分析：釀酒酵母的SAM 合成酶不能直接利用D-蛋氨酸. D-蛋氨酸被酵母細(xì)胞吸收后, 在胞內(nèi)消旋酶的作用下, 部分D-蛋氨酸可被轉(zhuǎn)化成L-蛋氨酸, 為SAM 合成提供前體. 發(fā)酵結(jié)果表明, 流加前體D-蛋氨酸, SAM 的積

10、累量最高為1. 53 g/ L, 僅為流加L-蛋氨酸前體時(shí)SAM 積累量的1/ 3, 蛋氨酸轉(zhuǎn)化率為5. 73%. 而生物量最高達(dá)到124 g/ L, 表明通過(guò)流加方式補(bǔ)加D-蛋氨酸對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用并不明顯。,補(bǔ)加前體DL-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果圖7, 8 為在生物量達(dá)到80 g/ L 時(shí)流加DL-蛋氨酸前體的發(fā)酵結(jié)果, 補(bǔ)加速率為4 g/ ( L . h) , 共流加5 h.,分析：在補(bǔ)加2 倍量的DL-蛋氨酸前體條件下,釀酒

11、酵母先利用L-蛋氨酸前體合成SAM, 同時(shí)D-蛋氨酸在酵母細(xì)胞內(nèi)消旋酶的作用下轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蛋氨酸, 有效補(bǔ)充了合成SAM 的前體, 從而更利SAM 的積累, SAM 的積累量最高為5. 28 g / L, 蛋氨酸的轉(zhuǎn)化率為9. 88% . 在該前體流加策略下, 生物量最高達(dá)131 g/ L, 表明流加2 倍量的DL-蛋氨酸對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響.,結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)分別以L-蛋氨酸、D-蛋氨酸和DL-蛋氨酸作為發(fā)酵前體, 考察了補(bǔ)加不同類型的

12、蛋氨酸前體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和SAM 積累的影響. 當(dāng)發(fā)酵過(guò)程中以2 g / ( L . h) 的速率流加D-蛋氨酸前體時(shí), SAM 的積累量為1. 53 g/ L, 生物量達(dá)124 g/ L; 以相同速率流加前體L-蛋氨酸時(shí),SAM 的積累量達(dá)4.68 g/ L,生物量為146 g / L。相比較而言,采用4 g/ ( L .h) 的速率流加DL-蛋氨酸前體時(shí), SAM 的積累量最高,可達(dá)5. 28 g/ L, 生物量為128 g / L,