西伯利亞蓼GST和CS基因雙價載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)酵母和煙草研究.pdf

1、本研究從鹽脅迫下的西伯利亞蓼cDNA文庫中獲得的GST和CS兩個基因，分別構(gòu)建了GST單基因、CS單基因及GST+CS雙基因酵母單價和雙價表達載體和植物單價和雙價表達載體，成功獲得了轉(zhuǎn)單雙價基因酵母和煙草，并進行了相關(guān)的分子生物學(xué)鑒定，分析了轉(zhuǎn)基因酵母和煙草的抗鹽、重金屬能力，以及轉(zhuǎn)單雙價基因酵母和煙草的比較及協(xié)同互做關(guān)系，主要研究成果如下：
　　1、對西伯利亞蓼GST和CS基因進行了生物信息學(xué)分析，初步表明GST屬于GST的Ta

2、u類家族，推測其在植物解除重金屬和鹽脅迫中起著重要作用。CS在信號肽引導(dǎo)下定位于細(xì)胞胞質(zhì)，為胞質(zhì)型蛋白。熒光定量RT-PCR分析顯示，3％ NaHCO3脅迫處理西伯利亞蓼2d后，GST和CS基因在葉和地下莖中均達到最大表達量，在莖中CS的最大表達量也出現(xiàn)在第2d，而GST基因最大表達量出現(xiàn)在第3d。GST和CS基因在去脅迫過程中在地下莖中的表達均上調(diào)，而在葉和莖中的表達呈下調(diào)趨勢。
　　2、構(gòu)建了GST基因的原核表達載體pET28

3、a-GST并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，成功表達出分子量為26 kDa的特異蛋白。在3％ NaHCO3脅迫狀態(tài)下，表達GST基因的大腸桿菌(BL21-pET28a-GST)的生長明顯快于對照(BL21-pET28a)，表明GST誘導(dǎo)的蛋白在3％ NaHCO3脅迫狀態(tài)下的表達能夠促進細(xì)菌的生長，初步證明GST基因具有抗鹽特性。
　　3、構(gòu)建了CS基因的真核表達載體pYES2-CS并轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中。實驗表明，在NaCl和NaHCO3脅迫下，轉(zhuǎn)

4、基因酵母(CS+)的存活率明顯高于對照酵母(CS-)，并且轉(zhuǎn)基因酵母菌體中GSH的含量和培養(yǎng)基中半胱氨酸含量均有增加，初步證明在酵母中過量表達CS基因能夠提高酵母的耐鹽性，證明CS基因具有抗鹽特性。
　　4、構(gòu)建了釀酒酵母單價表達載體pYES2-GST、pYES2-CS和雙價表達載體pYES2-GC，并轉(zhuǎn)入到釀酒酵母中，分別命名為轉(zhuǎn)基因酵母ty-gst、ty-cs和ty-gc。在lmol·L-1 NaHCO3和5 mol·L-1

5、NaCl脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因酵母(ty-gst、ty-cs和ty-gc)的耐鹽能力均高于野生型酵母(wy)，而三者之間并無顯著差別。在重金屬脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因酵母菌(ty-gst、ty-cs和ty-gc)的耐重金屬CdSO4和CuSO4能力均遠(yuǎn)高于野生型酵母（wy），其中轉(zhuǎn)基因酵母ty-gc的耐受CdSO4的能力最高，轉(zhuǎn)基因酵母菌ty-cs和ty-gc的耐重金屬CuSO4能力高于轉(zhuǎn)基因酵母ty-gst，說明GST和CS基因均具有耐受CuS

6、O4的能力。而轉(zhuǎn)雙價酵母菌中CS基因可能協(xié)助GST基因提高轉(zhuǎn)基因酵母耐受CuSO4的作用。
　　5、構(gòu)建了植物單價表達載體pROKⅡ-GST、pROKⅡ-CS和雙價表達載體pROKⅡ-GC，并轉(zhuǎn)入到煙草中，分別命名為轉(zhuǎn)基因煙草TY-GST、TY-CS和TY-GC。耐鹽性實驗顯示，TY-GST、TY-CS和TY-GC煙草的SOD和POD活性均高于野生型煙草對照（WY)。TY-GC和TY-GST、TY-CS之間的POD活性存在顯著差異