EST技術(shù)分析西伯利亞蓼耐鹽機(jī)制及耐鹽相關(guān)基因克隆.pdf

1、西伯利亞蓼(Polygonum sibiricum Laxm)為多年生草本植物，可在鹽堿地堿斑上生長(zhǎng)，為鹽堿地的優(yōu)勢(shì)種，是研究植物耐鹽堿脅迫的優(yōu)良材料。在以往對(duì)西伯利亞蓼的研究基礎(chǔ)上，本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究： 1．通過(guò)對(duì)西伯利亞蓼NaHCO<,3>混合cDNA文庫(kù)2575個(gè)EST的分析，拼接出1977個(gè)TUTs，其中包含206個(gè)重疊群(contig)和1771個(gè)單拷貝EST(singleton)。確定了高豐度表達(dá)、中豐度表達(dá)

2、EST和低豐度表達(dá)EST；高豐度表達(dá)基因51個(gè)，占所有TUT的2.6％，代表457個(gè)EST，占總EST的17.77％，其中參與光合作用的EST占高豐度表達(dá)基因的54.92％。表明NaHCO<,3>脅迫條件下葉部的主要生理功能仍為光合作用；中豐度表達(dá)基因154個(gè)，占所有TUT的7.8％，代表342個(gè)EST，占總EST的13.30％。低豐度單拷貝的EST 1771個(gè)，占總EST的68.86％，說(shuō)明文庫(kù)的復(fù)雜性較好。 利用BlastX

3、對(duì)1977個(gè)TUT進(jìn)行注釋，其中720個(gè)TUTs有明確的功能注釋，占總TUTs的36.42％；109個(gè)為未知蛋白，占總TUTs的5.51％，其余1238個(gè)則沒(méi)有明顯同源性而被鑒定為新基因，占總TUTs的62.62％。將720個(gè)TUT分成代謝、能量、光合作用、蛋白合成、轉(zhuǎn)運(yùn)組件、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞救援與防御和其它等九類，其中代謝、能量和光合所占的比例最高，分別達(dá)到22.90％、12.25％和11.86％，而細(xì)胞救援與防御類所占比例較低，

4、僅為1.24％，從而確定葉部雖然受到了NaHCO<,3>脅迫，但其主要功能如光合作用、代謝和能量仍處于主導(dǎo)地位，這也在一定程度上說(shuō)明了西伯利亞蓼具有耐脅迫能力。 2．以SMART策略構(gòu)建了西伯利亞蓼NaHCO<,3>脅迫48 h的葉部和莖部正反消減文庫(kù)，隨機(jī)挑取克隆測(cè)序，共獲得了2282條有效序列，其中莖的正向消減文庫(kù)中有598條，莖的負(fù)向消減文庫(kù)中有490條，葉的負(fù)向消減文庫(kù)中有567條，葉的正向消減文庫(kù)中有627條。通過(guò)進(jìn)行

5、MIPs功能分類并對(duì)莖部與葉部正反消減文庫(kù)比較，在鹽脅迫條件下，發(fā)現(xiàn)莖部與葉部的脅迫反應(yīng)有很大不同，莖部與葉部除細(xì)胞救援與防御、轉(zhuǎn)運(yùn)組件組中變化趨勢(shì)相同外，在代謝、能量、光合作用、蛋白合成、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)等方面均表現(xiàn)為相反的趨勢(shì)，其中莖部表現(xiàn)為脅迫抑制的有轉(zhuǎn)運(yùn)組件、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，而在葉部則表現(xiàn)為脅迫誘導(dǎo)。在莖部表現(xiàn)為脅迫誘導(dǎo)的光合作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量以及代謝，在葉部則表現(xiàn)為脅迫抑制。說(shuō)明葉部與莖部在NaHCO<,3>條件下具有兩種不

6、同應(yīng)答機(jī)制和分工，結(jié)合以往的研究結(jié)果，確定莖部在西伯利亞蓼的個(gè)體植株水平耐鹽機(jī)制中起到重要作用。 3．利用RACE技術(shù)克隆了17個(gè)與脅迫有關(guān)的cDNA，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，確定17個(gè)脅迫相關(guān)基因?yàn)樗ǖ赖鞍谆?、胚胎晚期富集蛋白基因、乙二醛酶Ⅱ基因、臭氧反?yīng)脅迫相關(guān)蛋白基因、谷氧還蛋白基因、超氧化物歧化酶(Mn)、超氧化物歧化酶(Cu-Zn)、廣泛應(yīng)激蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、銅伴侶、鈣調(diào)蛋白、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶、半胱氨酸合成