基于上轉換顆粒等新型納米材料的生物傳感方法研究.pdf

1、生物傳感技術由于其具有選擇性好、響應速度快、成本低和可進行在線分析等優(yōu)點，在實際分析檢測和生物醫(yī)藥領域得到了高度的重視和廣泛的應用。近些年，納米材料由于其獨特的量子尺寸效應、表面效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應等性質，表現(xiàn)出一系列與常規(guī)尺寸材料不同的光學、力學、磁學和電學等性能，因而在諸多領域發(fā)展迅猛。納米材料與生物傳感技術的相互結合，極大地推動了生命科學、納米科學和生物醫(yī)學等領域的快速發(fā)展。本論文基于上轉換熒光納米顆粒(UCNPs)

2、、氧化氫氧化鈷(CoOOH)納米片和熒光金納米簇(AuNCs)，發(fā)展低成本、操作簡便和靈敏度高的新型納米生物傳感方法，實現(xiàn)對磷脂酶D(PLD)、小分子、信使RNA(mRNA)和酶活性的靈敏檢測分析，同時實現(xiàn)對癌癥的傳感檢測、成像診斷以及協(xié)同治療。其具體內容如下:
　　第2章中，PLD是細胞內信號轉導的重要部分，涉及到重要的生物學過程，PLD在諸多癌癥中異常表達，因而可以視為癌癥中潛在的診斷生物標記物和藥物開發(fā)的靶標。我們發(fā)展了基于

3、磷脂修飾的上轉換納米探針用于比率型上轉換熒光(UCF)檢測和生物成像PLD活性。納米探針可通過疏水相互作用將聚乙二醇修飾的磷脂和羅丹明B標記的磷脂自組裝在疏水UCNPs表面。納米體系中發(fā)生了從UCNPs的540 nm處UCF發(fā)射與羅丹明B紫外吸收之間的熒光共振能量轉移(FRET)過程。PLD介導的磷酸二酯鍵水解使得羅丹明B遠離UCNP表面，導致FRET過程受到抑制。使用不受影響的655 nm處UCF發(fā)射作為內標，納米探針可以高靈敏和選擇

4、性地比率型UCF檢測PLD活性。此納米探針還可以檢測細胞裂解液中PLD活性，證實在乳腺癌細胞中PLD活性比正常乳腺細胞高出7倍。而且該納米探針還可以通過UCF生物成像來實現(xiàn)活細胞中PLD活性檢測。實驗結果證明，該納米探針提供了簡單、靈敏和穩(wěn)定的生物傳感平臺，可用于生物醫(yī)學領域中即時診斷和藥物篩選。
　　第3章中，抗壞血酸(AA)在很多生物化學過程中是一個關鍵的微量物質，并且容易清除活性氧。我們發(fā)展了CoOOH納米片修飾的上轉換納米

5、體系用于熒光檢測人血漿中AA活性。納米體系的組成是UCNPs作為能量供體，在UCNPs表面形成的CoOOH納米片作為有效的能量受體。在體系中，UCNPs的熒光發(fā)射與CoOOH納米片的紫外吸收之間發(fā)生了FRET過程。AA介導的特異性還原反應將CoOOH納米片還原成Co2+，抑制FRET過程，UCF發(fā)射得到恢復。納米體系可以用來靈敏和選擇性地檢測AA活性。由于UCNPs極小的背景干擾，納米體系可以應用于檢測人血漿樣品中AA水平，并且有較為滿

6、意的結果。該方法潛在地提供了一個用于AA相關疾病的研究和臨床診斷的分析平臺。
　　4章中，多功能納米顆粒平臺通常集合生物傳感、成像診斷和治療等多種作用于一體，對生物納米醫(yī)學和癌癥臨床診斷治療有著非常重要的意義。我們發(fā)展了基于多功能聚多巴胺(PDA)修飾的上轉換納米體系用于檢測細胞內mRNA和成像介導光動力學-光熱治療(PDT-PTT)協(xié)同作用。納米體系可以通過分步包覆修飾的方法合成，首先在疏水性UCNPs表面包覆一層薄SiO2殼層

7、，并摻雜光敏劑亞甲基藍(MB)，形成UCNP@SiO2-MB。繼續(xù)包覆一層PDA殼，即可制備核-殼-殼結構UCNP@SiO2-MB@PDA。由于PDA具有吸附單鏈DNA(ssDNA)并淬滅ssDNA上標記染料熒光的性質，且對雙鏈DNA(dsDNA)吸附能力較弱，可構建UCNP@SiO2-MB@PDA-hpDNA納米探針，用來檢測細胞內mRNA，實現(xiàn)所構建納米探針的檢測傳感和成像診斷性能;此外，通過UCNPs與MB間的FRET過程，使得U

8、CNP@SiO2-MB@PDA具有PDT功效;再者，由于PDA有強的紫外可見吸收，UCNPs的800 nm熒光發(fā)射峰可用來激發(fā)PDA產生光熱效應，因而UCNP@SiO2-MB@PDA具有PTT功效。本章中所發(fā)展的多功能PDA修飾的上轉換納米體系可將生物傳感、成像診斷和多功能治療作用集于一體，為設計新型多功能用于生物醫(yī)藥成像研究的納米復合物提供了有效的策略。
　　第5章中，多聚核苷酸激酶(PNK)催化核苷酸5’-OH末端的磷酸化作用

9、是不可避免的過程，且涉及到諸多重要的細胞生理活動。我們首次發(fā)現(xiàn)CoOOH納米片對ssDNA和dsDNA吸附有顯著差別，導致熒光染料標記的dsDNA與CoOOH納米片作用后仍具有強的熒光發(fā)射，而ssDNA熒光信號則被CoOOH納米片淬滅。結合λ外切酶水解反應，我們發(fā)展了基于CoOOH納米片的納米探針用于熒光檢測T4 PNK活性及抑制劑作用。在T4 PNK存在下，染料標記的dsDNA被磷酸化，接著被λ外切酶水解，產生染料標記的ssDNA，可

10、以吸附在CoOOH納米片上，導致熒光被CoOOH納米片淬滅。由于CoOOH納米片的高淬滅能力，使其可以作為有效的能量受體，成功構建了高靈敏和選擇性地檢測復雜生物學樣品中T4PNK活性的方法，且可以應用于篩選抑制劑。本文發(fā)展的方法對于核酸激酶相關疾病研究、臨床診斷和藥物發(fā)現(xiàn)具有很大的應用潛能。
　　第6章中，2，4，6-三硝基甲苯(TNT)是硝基芳香族爆炸物中的典型代表物質，對于環(huán)境安全問題和人類健康問題有著顯著的影響。我們發(fā)展了基

11、于谷胱甘肽修飾的熒光金納米簇(GSH-AuNCs)納米探針用于靈敏地熒光檢測TNT含量。在所構建的納米體系中，GSH-AuNCs納米探針中伯氨基基團孤對電子可以作為較好的電子供體，而目標物TNT中含有3個硝基吸電子基團可以作為較好的電子受體，通過電子供體-受體間特異性識別作用，可形成穩(wěn)定的Meisenheimer復合物，以FRET和形成團聚體的形式對GSH-AuNCs熒光進行雙重淬滅。所構建的熒光傳感方法，可以實現(xiàn)對TNT靈敏檢測，且可