基于上轉(zhuǎn)換顆粒等新型納米材料的生物傳感方法研究.pdf

1、生物傳感技術(shù)由于其具有選擇性好、響應(yīng)速度快、成本低和可進(jìn)行在線分析等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際分析檢測(cè)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到了高度的重視和廣泛的應(yīng)用。近些年，納米材料由于其獨(dú)特的量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等性質(zhì)，表現(xiàn)出一系列與常規(guī)尺寸材料不同的光學(xué)、力學(xué)、磁學(xué)和電學(xué)等性能，因而在諸多領(lǐng)域發(fā)展迅猛。納米材料與生物傳感技術(shù)的相互結(jié)合，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)、納米科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的快速發(fā)展。本論文基于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒(UCNPs)

2、、氧化氫氧化鈷(CoOOH)納米片和熒光金納米簇(AuNCs)，發(fā)展低成本、操作簡(jiǎn)便和靈敏度高的新型納米生物傳感方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)磷脂酶D(PLD)、小分子、信使RNA(mRNA)和酶活性的靈敏檢測(cè)分析，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的傳感檢測(cè)、成像診斷以及協(xié)同治療。其具體內(nèi)容如下:
　　第2章中，PLD是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要部分，涉及到重要的生物學(xué)過(guò)程，PLD在諸多癌癥中異常表達(dá)，因而可以視為癌癥中潛在的診斷生物標(biāo)記物和藥物開發(fā)的靶標(biāo)。我們發(fā)展了基于

3、磷脂修飾的上轉(zhuǎn)換納米探針用于比率型上轉(zhuǎn)換熒光(UCF)檢測(cè)和生物成像PLD活性。納米探針可通過(guò)疏水相互作用將聚乙二醇修飾的磷脂和羅丹明B標(biāo)記的磷脂自組裝在疏水UCNPs表面。納米體系中發(fā)生了從UCNPs的540 nm處UCF發(fā)射與羅丹明B紫外吸收之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)過(guò)程。PLD介導(dǎo)的磷酸二酯鍵水解使得羅丹明B遠(yuǎn)離UCNP表面，導(dǎo)致FRET過(guò)程受到抑制。使用不受影響的655 nm處UCF發(fā)射作為內(nèi)標(biāo)，納米探針可以高靈敏和選擇

4、性地比率型UCF檢測(cè)PLD活性。此納米探針還可以檢測(cè)細(xì)胞裂解液中PLD活性，證實(shí)在乳腺癌細(xì)胞中PLD活性比正常乳腺細(xì)胞高出7倍。而且該納米探針還可以通過(guò)UCF生物成像來(lái)實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中PLD活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該納米探針提供了簡(jiǎn)單、靈敏和穩(wěn)定的生物傳感平臺(tái)，可用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中即時(shí)診斷和藥物篩選。
　　第3章中，抗壞血酸(AA)在很多生物化學(xué)過(guò)程中是一個(gè)關(guān)鍵的微量物質(zhì)，并且容易清除活性氧。我們發(fā)展了CoOOH納米片修飾的上轉(zhuǎn)換納米

5、體系用于熒光檢測(cè)人血漿中AA活性。納米體系的組成是UCNPs作為能量供體，在UCNPs表面形成的CoOOH納米片作為有效的能量受體。在體系中，UCNPs的熒光發(fā)射與CoOOH納米片的紫外吸收之間發(fā)生了FRET過(guò)程。AA介導(dǎo)的特異性還原反應(yīng)將CoOOH納米片還原成Co2+，抑制FRET過(guò)程，UCF發(fā)射得到恢復(fù)。納米體系可以用來(lái)靈敏和選擇性地檢測(cè)AA活性。由于UCNPs極小的背景干擾，納米體系可以應(yīng)用于檢測(cè)人血漿樣品中AA水平，并且有較為滿

6、意的結(jié)果。該方法潛在地提供了一個(gè)用于AA相關(guān)疾病的研究和臨床診斷的分析平臺(tái)。
　　4章中，多功能納米顆粒平臺(tái)通常集合生物傳感、成像診斷和治療等多種作用于一體，對(duì)生物納米醫(yī)學(xué)和癌癥臨床診斷治療有著非常重要的意義。我們發(fā)展了基于多功能聚多巴胺(PDA)修飾的上轉(zhuǎn)換納米體系用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA和成像介導(dǎo)光動(dòng)力學(xué)-光熱治療(PDT-PTT)協(xié)同作用。納米體系可以通過(guò)分步包覆修飾的方法合成，首先在疏水性UCNPs表面包覆一層薄SiO2殼層

7、，并摻雜光敏劑亞甲基藍(lán)(MB)，形成UCNP@SiO2-MB。繼續(xù)包覆一層PDA殼，即可制備核-殼-殼結(jié)構(gòu)UCNP@SiO2-MB@PDA。由于PDA具有吸附單鏈DNA(ssDNA)并淬滅ssDNA上標(biāo)記染料熒光的性質(zhì)，且對(duì)雙鏈DNA(dsDNA)吸附能力較弱，可構(gòu)建UCNP@SiO2-MB@PDA-hpDNA納米探針，用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA，實(shí)現(xiàn)所構(gòu)建納米探針的檢測(cè)傳感和成像診斷性能;此外，通過(guò)UCNPs與MB間的FRET過(guò)程，使得U

8、CNP@SiO2-MB@PDA具有PDT功效;再者，由于PDA有強(qiáng)的紫外可見(jiàn)吸收，UCNPs的800 nm熒光發(fā)射峰可用來(lái)激發(fā)PDA產(chǎn)生光熱效應(yīng)，因而UCNP@SiO2-MB@PDA具有PTT功效。本章中所發(fā)展的多功能PDA修飾的上轉(zhuǎn)換納米體系可將生物傳感、成像診斷和多功能治療作用集于一體，為設(shè)計(jì)新型多功能用于生物醫(yī)藥成像研究的納米復(fù)合物提供了有效的策略。
　　第5章中，多聚核苷酸激酶(PNK)催化核苷酸5’-OH末端的磷酸化作用

9、是不可避免的過(guò)程，且涉及到諸多重要的細(xì)胞生理活動(dòng)。我們首次發(fā)現(xiàn)CoOOH納米片對(duì)ssDNA和dsDNA吸附有顯著差別，導(dǎo)致熒光染料標(biāo)記的dsDNA與CoOOH納米片作用后仍具有強(qiáng)的熒光發(fā)射，而ssDNA熒光信號(hào)則被CoOOH納米片淬滅。結(jié)合λ外切酶水解反應(yīng)，我們發(fā)展了基于CoOOH納米片的納米探針用于熒光檢測(cè)T4 PNK活性及抑制劑作用。在T4 PNK存在下，染料標(biāo)記的dsDNA被磷酸化，接著被λ外切酶水解，產(chǎn)生染料標(biāo)記的ssDNA，可

10、以吸附在CoOOH納米片上，導(dǎo)致熒光被CoOOH納米片淬滅。由于CoOOH納米片的高淬滅能力，使其可以作為有效的能量受體，成功構(gòu)建了高靈敏和選擇性地檢測(cè)復(fù)雜生物學(xué)樣品中T4PNK活性的方法，且可以應(yīng)用于篩選抑制劑。本文發(fā)展的方法對(duì)于核酸激酶相關(guān)疾病研究、臨床診斷和藥物發(fā)現(xiàn)具有很大的應(yīng)用潛能。
　　第6章中，2，4，6-三硝基甲苯(TNT)是硝基芳香族爆炸物中的典型代表物質(zhì)，對(duì)于環(huán)境安全問(wèn)題和人類健康問(wèn)題有著顯著的影響。我們發(fā)展了基

11、于谷胱甘肽修飾的熒光金納米簇(GSH-AuNCs)納米探針用于靈敏地?zé)晒鈾z測(cè)TNT含量。在所構(gòu)建的納米體系中，GSH-AuNCs納米探針中伯氨基基團(tuán)孤對(duì)電子可以作為較好的電子供體，而目標(biāo)物TNT中含有3個(gè)硝基吸電子基團(tuán)可以作為較好的電子受體，通過(guò)電子供體-受體間特異性識(shí)別作用，可形成穩(wěn)定的Meisenheimer復(fù)合物，以FRET和形成團(tuán)聚體的形式對(duì)GSH-AuNCs熒光進(jìn)行雙重淬滅。所構(gòu)建的熒光傳感方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)TNT靈敏檢測(cè)，且可